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Tala Fou

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Ua fa'atupuina e sela o le kanesa ni auala eseese e fo'ia ai le mamafa o le tino ma fa'aauau pea le alualu i luma.Protein kinase R (PKR) ma lona protein activator (PACT) o uluai tali ia e mataʻituina faʻailoga faʻalavelave eseese e taʻitaʻia ai le faʻalavelaveina o le faʻateleina o le cell ma apoptosis.Ae ui i lea, o le faʻatonutonuina o le ala PACT-PKR i sela o le kanesa e tumau pea ona le iloa.O iinei, na matou iloa ai o le umi e le-coding RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) o loʻo aʻafia saʻo i le faʻalavelaveina o le ala PACT-PKR ma faʻateleina le faʻateleina o sela o le kanesa.I le fa'aaogaina o su'esu'ega fa'atino tele o le CRISPRi 971 lncRNA e feso'ota'i ma le kanesa, na matou iloa ai o le DARS-AS1 na feso'ota'i ma le fa'ateleina o le fa'ateleina o le kanesa.O le mea lea, o le tu'itu'i DARS-AS1 e taofia ai le fa'atuputeleina o sela ma fa'aolaina le apoptosis o le kanesa i laina sela o le kanesa i vitro ma fa'aitiitia ai le tuputupu a'e o le tuma i vivo.Faʻainisinia, DARS-AS1 faʻapipiʻi saʻo i le PACT activation domain ma taofia le PACT-PKR fegalegaleaiga, ma faʻaitiitia ai le faʻagaioiina o PKR, eIF2α phosphorylation, ma faʻalavelaveina le apoptotic cell death.I le falema'i, o le DARS-AS1 o lo'o fa'aalia lautele i le tele o kanesa, ma o le fa'aalia o lenei lncRNA o lo'o fa'aalia ai le leaga o le fa'asologa.O lenei su'esu'ega e fa'amalamalama ai le fa'atonuga fa'apitoa mo le kanesa o le ala PACT-PKR e DARS-AS1 lncRNA ma maua ai se isi fa'amoemoe mo fa'ama'i ma togafitiga o le kanesa.
O le mafai ona fetuutuunai i le atuatuvale o se uiga taua o le ola ma le faʻateleina o sela o le kanesa.O le televave o le fa'atuputeleina ma fa'ailoga o le kanesa o lo'o maualuga i totonu o si'osi'omaga fa'aletonu-le maua o mea'ai, hypoxia, ma le maualalo o le pH-e mafai ona fa'aoso ai ala fa'ailo o le oti.O le faʻaleagaina o kenera faʻalavelave faʻalavelave e pei o le p535, polotini vevela vevela 6, 7, KRAS8, 9, ma le HIF-110, 11, 12, 13 e masani ona matauina i le kanesa, ma taofia ai le apoptosis ma faʻaleleia le ola.
Protein kinase R (PKR) o se faʻamaʻi faʻamaʻi taua ma subunit kinase o le eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α), o se faʻasalalauga faʻaliliuga e fesoʻotaʻi ai le mamafa o le cellular i le cell death.O le PKR na muai faailoaina o se polotini antiviral e ala i le mauaina o se RNA fa'alua fa'alua mai fafo (dsRNA).I luga o le faʻagaoioia, PKR phosphorylates eIF2α e faʻalavelave ai viral ma cellular protein synthesis14,15,16.PACT (PKR activator protein) ua faailoaina o le muamua PKR activator protein i le leai o dsRNA17,18,19,20,21,22,23.E ala i fegalegaleaiga tuusao ma le PKR, o le PACT e faʻaliliuina ai faʻafitauli eseese (serum matelaina, peroxide poʻo arsenite togafitiga) i PKR ma ala faʻailoga i lalo.I le faaopoopo atu i le eIF2α phosphorylation, o le PACT-mediated PKR activation e mafua ai mea eseese e fesoʻotaʻi ma le faʻalavelave faʻalavelave, e aofia ai le suiga o le redox tulaga e ala i le ala PI3K / Akt24, faʻaleleia le siakiina o DNA e ala i le p5325,26 ma le NF-κB27,28 Faʻatonuina tusitusiga, 29. Ona o la latou matafaioi taua i le faʻalavelave faʻalavelave, faʻateleina, apoptosis ma isi faʻagasologa telefoni feaveaʻi, PKR ma PACT o loʻo folafola atu faʻamoemoega togafitiga mo le tele o faʻamaʻi, aemaise lava le kanesa30,31,32,33.Ae ui i lea, e ui lava i lenei faʻaogaina ma le taua o le olaola, o le tulafono faatonutonu o le PACT / PKR gaioiga i sela o le kanesa e tumau pea le le mautonu.
lncRNAs o tusitusiga e sili atu nai lo le 200 nucleotides e leai se mea e mafai ona faʻaogaina ai le polotini.Talu ai o galuega fa'asolosolo fa'asologa o genome atoa ua fa'ailoaina le faitau afe o lncRNAs, 35,36 tele taumafaiga ua faia e fa'amalamalama a latou galuega fa'ale-ola.O le tuputupu a'e o su'esu'ega ua fa'aalia ai o lncRNA o lo'o a'afia i le tele o faiga fa'aola37 e aofia ai le fa'atonutonuina ole X-chromosome inactivation38,39, fa'ailoga40, transcription41,42, fa'aliliuga43 ma e o'o lava ile tuputupu a'e ole kanesa44,45,46,47.O nei su'esu'ega na lipotia mai e tele lncRNA o lo'o a'afia i le ala PACT/PKR.O se tasi o ia suʻesuʻega na faʻaalia ai o lncRNA ASPACT na faʻalavelaveina le PACT transcription ma faʻateleina le faʻatumauina o le PACT mRNA.O isi suʻesuʻega ua faʻaalia ai o le lncRNA nc886 e fusifusia i PKR ma faʻalavelaveina lona phosphorylation49,50.E oʻo mai i le taimi nei, e leʻi lipotia mai le lncRNA faʻatonutonuina le faʻagaioiina o PKR-mediated PACT.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ua faailoaina o se oncogenic lncRNA51,52,53,54.E ala i le faatonutonuina o le miP-194-5p53, miP-12952 ma le miP-532-3p51, ua faʻaalia le DARS-AS1 e faʻaleleia ai le tuputupu aʻe o le faʻamaʻiina o le tino o le tino, o le thyroid carcinoma ma le tino e le o le tino laiti, i le faasologa.Na maua foi e Tong ma ana uo o le DARS-AS1 e faʻamalosia le alualu i luma o le myeloma e ala i le faatumauina o le mautu o le porotini 39 (RBM39) RNA-binding motif.Ae ui i lea, e leai ni suʻesuʻega na faia pe o lenei lncRNA o loʻo aʻafia i le faʻatonutonuina o le faʻagaioiina o le PACT-PKR ma le faʻalavelave faʻalavelave o sela o le kanesa.
O iinei, na matou faia ai se mataʻutia tele o le leiloa o galuega e faʻaaoga ai le CRISPRi system ma faʻamautinoa ai o DARS-AS1 lncRNA e faʻamalosia le faʻateleina o le tele o ituaiga o sela o le kanesa.E le gata i lea, ua matou faʻaalia se faiga tele: DARS-AS1 faʻapipiʻi saʻo i le PACT, faʻalavelaveina le PACT ma le PKR fusifusia, puipuia le phosphorylation o le eIF2α, o le lalo ifo o le PKR substrate, ma iu ai ina taofia le apoptotic cell death.I le faaiuga, o la matou galuega o loʻo faʻaalia ai le DARS-AS1 lncRNA o se faʻatonuga o le auala PACT-PKR ma se faʻamoemoega mo togafitiga ma faʻamaʻi o le kanesa.
O su'esu'ega fa'avasega fa'a-genomic ua iloa ai le faitau selau o lncRNA e feso'ota'i ma le kanesa.Ae ui i lea, o la latou galuega e tumau pea ona le iloa56.Ina ia iloa ai sui tauva lncRNA folafola e aafia i le alualu i luma o le kanesa, na matou faia se mata e leiloa-o-galuega mo le faaitiitia o le faateleina i le SW620 colorectal cancer cell line e faaaoga ai le CRISPRi system (Fig. 1a).O le uiga tulaga ese o le SW480 ma le SW620 colon cancer cell laina e mafua mai i le tumo muamua ma le lua ile ma'i e tasi.E maua ai se fa'atusatusaga taua mo le su'esu'eina o suiga ole kenera ile alualu i luma ole kanesa colon.O le mea lea, na matou suʻesuʻeina faʻamaumauga o laina sela o le kanesa colorectal (SW480 ma SW620) e faʻaaoga ai le RNA sequencing ma aoina mai nisi o lncRNAs aoga mai tusitusiga lolomi.Fa'avae i luga o nei fa'ai'uga, na matou mamanuina ai se faletusi sgRNA fa'apipi'iina o lo'o iai le 7355 sgRNA oligos e fa'atatau i le 971 cancer-related lncRNAs ma le 500 untargeted sgRNA oligos mo se fa'atonuga le lelei (Fa'amatalaga Faaopoopo 1).
Fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga o su'esu'ega e fa'aaoga ai le CRISPRi system.b sgRNA faʻatamaoaigaina pe a uma le suʻega.O le laina togitogi faalava o lo'o fa'atusalia le log2 (suiga gauga) = ±0.58.O le laina togitogi tu'usa'o e fa'ailoa ai le tau o le p = 0.05.O togitogi uliuli o lo'o fa'atusalia ai le sgRNA e le fa'atatauina (fa'ailogaina o le NC).O togitogi mumu o sgRNA e fa'atatau i le DARS-AS1.O togitogi lanumoana o sgRNA e faʻatatau i le LINC00205, o se lncRNA oncogenic na faʻamatalaina muamua.suiga gauga = (faitau masani, aso 17)/(faitau masani, aso 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown na taofia le tuputupu aʻe o sela.Fa'amau sese e fai ma sui o le ± fa'asologa masani o su'ega e tolu.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 su'ega-t a le A'oga lua-si'u.d DARS-AS1 faʻamatalaga i tuma (TCGA dataset).em Faʻaaliga o DARS-AS1 i faʻataʻitaʻiga masani masani ma tumo mai tagata mamaʻi ma le BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, ma le COAD, i le faasologa (TCGA dataset).P-values ​​​​na maua i le faʻaogaina o le suʻega a le Student's t-suʻega lua.
Ina ua uma ona fausia le plasmid ma afifiina le lentivirus, na matou faaliliuina le laina sela o le kanesa colorectal dCas9-SW620 ma le faletusi o loʻo i luga i faʻataʻitaʻiga faʻamaʻi tutoʻatasi.O le tele o faʻamaʻi (MOI) mo nei faʻamaʻi o le 0.1-0.3, e faʻaalia ai e naʻo le tasi le sgRNA e mafai ona feaveaʻi sela taʻitasi.Ina ua mavae le 18 aso o le in vitro culture, o le faʻatamaoaigaina o le sgRNAs taulaʻi na faʻaititia pe faʻateleina pe a uma le suʻega, ae o le numera o le oligonucleotides e le o faʻatatauina e tumau pea le le suia pe a faʻatusatusa i le muaʻi suʻesuʻeina talaaga, e faʻaalia ai o la tatou sini e maualuga le mataʻutia. faletusi.Alaisa.1b ma le laulau faaopoopo 1). LINC00205, lea na lipotia muamua e faʻaleleia ai le kanesa o le mama ma le kanesa o le ate le alualu i luma58,59,60, na faʻamaonia (log2 (foldchange) <-0.58, p value <0.05), faʻamaonia le faʻamaoni o lenei suʻega (Fig 1b). LINC00205, lea na lipotia muamua e faʻaleleia ai le kanesa o le mama ma le kanesa o le ate le alualu i luma58,59,60, na faʻamaonia (log2 (foldchange) <-0.58, p value <0.05), faʻamaonia le faʻamaoni o lenei suʻega (Fig 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, na lipotia muamua e faʻalauiloa le alualu i luma o le kanesa o le tino ma le kanesa o le ate58,59,60, na le aofia ai (log2 (suiga gauga) <-0.58, p-value <0.05), faʻamaonia le malosi o lenei suʻega (Fig.1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, na lipotia muamua e faʻaleleia le alualu i luma o le kanesa o le mama ma le ate58,59,60, na le aofia ai (log2 (suiga gauga) <-0.58, p-value <0.05), faʻamaonia le malosi o lenei suʻega (Fig.1b).
I totonu o lncRNA uma na fa'ata'ita'iina, sa su'esu'eina fo'i le DARS-AS1, fa'atasi ai ma le fa'aitiitia o le sgRNA oligonucleotides e tolu ina ua mae'a le 18 aso o le aganu'u, ma fa'ailoa mai ai o le tu'itu'i o lenei lncRNA na i'u ai i le fa'aitiitia o le fa'ateleina o le kanesa (Fig. 1b).O lenei taunuuga na lagolagoina atili e le MTS suʻesuʻega i sela o le kanesa colorectal o loʻo faʻaalia ai o le tuputupu aʻe o le DARS-AS1 knockdown cell na naʻo le afa pe a faʻatusatusa i sela pulea (Ata 1c) ma sa ogatasi ma lipoti muamua o isi ituaiga o kanesa.: kanesa mama fatugao sela, kanesa lauroid ma kanesa mama mama e le o ni sela laiti51,52,53,55.Ae ui i lea, o lona aoga ma faiga mole mole i le kanesa colorectal e tumau pea le le suʻesuʻeina.O le mea lea, na matou filifilia ai lenei lncRNA mo nisi suʻesuʻega.
Ina ia suʻesuʻeina le faʻaaliga DARS-AS1 i tagata mamaʻi, matou te suʻesuʻeina faʻapitoa 10,327 faʻataʻitaʻiga tumo mai le poloketi Cancer Genome Atlas (TCGA).O a matou faʻaiʻuga o loʻo faʻaalia ai le DARS-AS1 o loʻo faʻaalia lautele ma faʻamalosia tele i sela soifua maloloina i tumo eseese, e aofia ai le colon adenocarcinoma (COAD), faʻamaʻi mama o le tino (KIRC), ma le tino papillary cell carcinoma (KIRP)..E toaitiiti lava (Fig. 1d ma le Faaopoopo Ata. 1a, b). O le suʻesuʻeina o faʻataʻitaʻiga o le soifua maloloina / tumo ua faʻamaonia atili ai le maualuga o le faʻaalia o le DARS-AS1 i le tuma o le urothelial carcinoma (BLCA), fatugaʻo mama o le tino (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), mama squamous cell carcinoma (LUSC) , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), ate hepatocellular carcinoma (LIHC), fatuga'o papillary cell carcinoma (KIRP), ma colon adenocarcinoma (COAD) (p tau <0.05) (Fig 1e-m) . O le suʻesuʻeina o faʻataʻitaʻiga o le soifua maloloina / tumo ua faʻamaonia atili ai le maualuga o le faʻaalia o le DARS-AS1 i le tuma o le urothelial carcinoma (BLCA), fatugaʻo mama o le tino (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), mama squamous cell carcinoma (LUSC) , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), ate hepatocellular carcinoma (LIHC), fatuga'o papillary cell carcinoma (KIRP), ma colon adenocarcinoma (COAD) (p tau <0.05) (Fig 1e-m) .O suʻesuʻega o faʻataʻitaʻiga faʻasoifua maloloina / tumo faʻamaonia na faʻamaonia ai foi le maualuga o le faʻaalia o le DARS-AS1 i le taʻavale urothelial carcinoma (BLCA), faʻamaʻi faʻamaʻi ma le tino (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), mama squamous cell carcinoma (LUSC) tuma., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , kanesa endometrial o le tino (UCEC), adenocarcinoma o le mama (LUAD), hepatocellular carcinoma o le ate (LIHC), papillary cell carcinoma o fatuga'o (KIRP), ma adenocarcinoma o le kolone (COAD) (p tau < 0.05) (Ata. 1e– m) .配对 健康 / 肿瘤样本 肿瘤样本 的 进 进 进 dars-pei o1 尿路 尿路 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 (brca), 肿瘤 (irc 透明 (prarc), 肿瘤 (irc), 细胞癌 (pra), 肿瘤 (proc)显着 更 更 更 表达<0.05）（图1e-m） .配 对 健康 / 肿瘤样本 的 的 证实 了 dar-os1 在 尿路 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 细胞癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 (prad), 腺腺癌 (prad), 腺腺癌 (vide) (lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（ucel） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （lihc） 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .O suʻesuʻega o faʻataʻitaʻiga faʻasoifua maloloina / tumo na lagolagoina atili le matafaioi a le DARS-AS1 i le vevela urothelial carcinoma (BLCA), faʻamaʻi faʻamaʻi toto (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), ma le mama squamous cell carcinoma (LUSC) tuma.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). faʻamatalaga i le tino o le tino (UCEC), mama adenocarcinoma (LUAD), hepatocellular carcinoma (LIHC), fatu papillary cell carcinoma (KIRP), ma le colon adenocarcinoma (COAD) (p tau <0.05) (Ata 1e -m).Faʻatasi, o nei faʻaiʻuga e faʻaalia ai o le DARS-AS1 e lautele ma faʻaalia maualuga i le tele o kanesa.
Talu ai ona o le DARS-AS1 ma le DARS (le gene encoding the antisense strand) faʻasoa tutusa le faʻalauiloaina ma o loʻo tu i tafatafa o le tasi ma le isi, na matou mamanuina le shRNA e tuʻituʻi faapitoa ai le DARS-AS1 ae le o le DARS (Faʻaopoopo Ata 2a,b ma le Laulau Faʻaopoopo 2). .I le faʻaopoopoga i le SW620, matou te faʻaogaina foʻi isi laina telefoni e tolu e faʻaalia ai le DARS-AS1 e suʻesuʻe ai le aoga ma le aoga o le shRNA knockdown (Faʻaopoopo Faʻamatalaga 3).O a matou taunuʻuga na faʻaalia ai o shRNA uma e tolu na atiaʻe na ausia le itiiti ifo i le 80% DARS-AS1 knockdown lelei ma sina aafiaga itiiti i le aofaʻi o DARS mRNA (Faʻaopoopo Ata 2c-f).E le gata i lea, na matou iloa ai o le tuʻituʻi o le DARS-AS1 ma nei shRNA na matua taofia ai le tuputupu aʻe o sela i laina sela o le kanesa colorectal SW620 (49.7%) ma le HCT116 (27.7%), laina sela o le kanesa o le susu MBA-MD-231 (53.4%).) ma le HepG2 hepatoma cell line (92.7% faʻaitiitiga), faʻapea foʻi ma lo latou gafatia e fausia ai ni spheres e le faʻaogaina (faʻaititia o le ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% ma le 75.7% i le laina cell) (Fig. 2a,b).I le SW620, o faʻaiʻuga o suʻesuʻega faʻavae colony na faʻamaonia atili ai o le DARS-AS1 shRNA na matua faʻalavelaveina le faʻateleina o le cell ma le faʻaititia o le tusa ma le 69.6% (Fig. 2c).
Aafiaga o le pulea o le shRNA ma le DARS-AS1 shRNA i luga o le faʻalauteleina o le cell (a) ma le spheroid formation (b) i le SW620, HCT116, MBA-MD-231, ma le HepG2 sela.c Aafiaga o le pulea o le shRNA ma le DARS-AS1 shRNA i luga o le fausiaina o kolone i sela SW620.Ole fa'atuputeleina ole sela (d), le fa'atupuina o le spheroid (e), ma le fa'atupuina o kolone (f) o sela SW620 o lo'o fa'aalia le DARS-AS1.O fa'amaumauga o lo'o fa'aalia o le averesi ± fa'asologa masani o su'ega se tolu.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, ma le *** p ≤ 0.001 e ala i le su'ega-t a Tamaiti aoga e lua-si'u.
Ina ia faʻamalieina suʻesuʻega leiloa-o-galuega, na matou faia ai le SW620 sela o loʻo faʻaalia le DARS-AS1 (Faʻaopoopo Ata 2g).O le overexpression o le DARS-AS1 na matua faateleina ai le tuputupu aʻe o le sela (1.8-fold), le faʻaogaina o le spheroid (1.4-fold), ma le faʻatulagaina o kolone (3.3-fold) i sela SW620 (Fig. 2d-f).Na matou faʻamaonia lenei taunuʻuga e faʻaaoga ai le isi DARS-AS1 faʻaalia laina telefoni, A549.O lenei faʻalauteleina o le faʻalauteleina o le cell ona o le faʻaalia o le DARS-AS1 na toe matauina i sela A549 (Faʻaopoopoga Ata 2h, i ma le Laulau Faʻaopoopo 3).Ile tu'ufa'atasia, o nei su'esu'ega o tupe maua ma le gau o lo'o fa'aalia ai o le DARS-AS1 e fa'aolaina ai le fa'atuputeleina o sela o le kanesa i vitro.
Ina ia suʻesuʻeina le faiga faʻavae lea e faʻatonutonu ai e le DARS-AS1 le faʻalauteleina o sela, matou te faia se suʻesuʻega toso i lalo o le RNA e iloa ai ana paʻaga e mafai ona fusifusia porotini.RT-qPCR iʻuga na faʻaalia ai e uiga i le 86.2% o le DARS-AS1 o loʻo i totonu o le cytoplasm o sela SW620 (Faʻaopoopo Ata 3a).O le in vitro na tusia biotinylated DARS-AS1 poʻo le pseudoRNA na faʻapipiʻiina i le SW620 cell lysates sosoo ai ma le SDS-PAGE separation.O le faʻailoga siliva mulimuli na faʻaalia ai o se fusi maʻoti (~ 38 kDa) na matua faʻatamaoaigaina i faʻataʻitaʻiga toso DARS-AS1 ae le o faʻataʻitaʻiga RNA poʻo faʻataʻitaʻiga (Fig. 3a).O lenei faaili na faailoaina o se PKR activating protein (PACT) e ala ile tele spectrometry (MS) ma faʻamaonia atili ile immunoblotting ile SW620, HCT116, ma le HepG2 laina sela (Fig. 3a,b).O le faʻatamaoaigaina o le DARS ma le PACT e fesoʻotaʻi ma polotini - PKR ma TRBP - na suʻesuʻeina foi i le faʻaaogaina o le RNA suʻesuʻega e Western blotting (WB).O faʻaiʻuga na faʻaalia ai e leai se fegalegaleaiga tuusaʻo i le va o le DARS-AS1 RNA ma nei polotini e tolu na maua (Faʻaopoopo Ata 3b).O fesoʻotaʻiga faʻapitoa i le va o le DARS-AS1 ma le PACT na faʻamaonia atili e le RNA immunoprecipitation (RIP) suʻesuʻega, lea na faʻaalia ai o le DARS-AS1 na matua faʻatamaoaigaina i anti-PACT antibodies ae le o isi RNAs pulea (Ata 3c).Ina ia iloa pe fegalegaleai saʻo le DARS-AS1 ma le PACT i le leai o se isi vaega feaveaʻi, o se suʻega in vitro biolayer interferometry (BLI) na faia e faʻaaoga ai le PACT mama.Biotin-faʻailoga DARS-AS1 poʻo le dummy RNA na faʻaogaina i luga ole streptavidin (SA) biosensors ona faʻapipiʻiina lea i le kinetic buffer o loʻo i ai le 1 μM PACT.O le mea moni, o le PACT o loʻo fusia malosi i le DARS-AS1 (KD tau ~ 26.9 nM), ae le o le faʻataʻitaʻiina o le RNA (Ata 3d).Faʻatasi, o nei taunuʻuga o loʻo faʻaalia ai se fegalegaleaiga tuusaʻo ma le maualuga o le vavalalata i le va o DARS-AS1 ma PACT.
RNA toso suʻesuʻega faʻamaonia DARS-AS1 fegalegaleai ma PACT i SW620 sela.I luga, fa'ailoga siliva o polotini fa'atasi.O lo'o i lalo ole immunoblots na faia ile anti-PACT antibody.b RNA toso i lalo suʻesuʻega na faia i le HCT116 (pito i luga) ma le HepG2 (lalo) sela.O le fa'atamaoaigaina o le PACT na maua i le immunoblotting.cRNA immunoprecipitation (RIP) suʻega na faia i SW620 sela e faʻaaoga ai faʻamaʻi faʻaalia.d PACT fusifusia pupuni i le umi atoa DARS-AS1 poʻo le pulea RNA na maua i le faʻaogaina o le biolayer interferometry (BLI).O le RNA na le mafai ona gaoioi i luga o se streptavidin biosensor.1 μM PACT na faʻaaogaina e fua ai le mafutaga.e RNA toso su'esu'ega na faia i le fa'aogaina o le biotinylated atoa le DARS-AS1 po'o le tipi (pito i luga).Immunoblot fa'aalia PACT maua (lalo).f PACT fa'amamāina fu'a sa fa'a'ofuina i le biotinylated umi-umi atoa DARS-AS1 po'o le tipi (pei o le e) mo su'esu'ega in vitro RIP.O le RNA na maua mai na faʻamaonia e le RT-qPCR.g O le fesoʻotaʻiga vavalalata o vaega eseese o le RNA mo le PACT na maua mai i le faʻaogaina o le biolayer interferometry.Mo le auiliiliga, 100 nM RNA ma 1 μM RAST na faʻaaogaina.Sa faia su'esu'ega RIP in vitro e fa'aaoga ai le PACT fa'amama fa'amama po'o le tipiina.O le RNA na maua mai na faʻamaonia e le RT-qPCR.i Fa'atuputeleina o sela SW620 o lo'o fa'aalia le DARS-AS1, PACT, po'o mea uma e lua.j O le fa'aaliaina o le umi atoa po'o le tipiina o le DARS-AS1 i sela SW620 na i ai aafiaga eseese i le tuputupu a'e o sela.k Apoptosis na maua e ala ile immunoblotting ile anti-PARP antibody.l Knockout o le DARS-AS1 fa'aosoina apoptosis o sela SW620 e pei ona fa'aalia i le cytometry tafe.O fa'amaumauga o lo'o fa'aalia o le averesi ± fa'asologa masani o su'ega se tolu. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, e ala i le su'ega t a Tamaiti e lua si'usi'u. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, e ala i le su'ega t a Tamaiti e lua si'usi'u. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 e ala i le su'ega-t a Tamaiti aoga e lua-si'u. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 e ala i le su'ega-t a Tamaiti aoga e lua-si'u.
Ona matou faia lea o ni vaega se tolu biotinylated DARS-AS1 RNA e ala i le in vitro transcription e iloa ai le DARS-AS1 e manaʻomia mo le PACT association (Ata 3e).O faʻamatalaga suʻesuʻega a le RNA na faʻaalia ai o vaega taʻitasi na mafai ona fegalegaleai ma le PACT, ae o le 3'-terminal region (384-768 nucleotides faʻaigoaina A3) na faʻaalia ai le sili atu i le 1-384 nucleotides faʻailoga A1) (Fig. 3e).O fa'ai'uga fa'apenei na matauina ile su'esu'ega in vitro RIP e fa'aaoga ai le PACT recombinant (Ata 3f).E tusa ai ma nei taunuʻuga, o faʻataʻitaʻiga e fusifusia ai vaega o le RNA immobilized i le PACT e faʻaaoga ai le BLI na faʻaalia ai foi o le PACT o loʻo i ai le maualuga maualuga mo le A3 (384-768 nt) (KD tau e tusa ma le 94.6 nM), ae toetoe lava leai se fesoʻotaʻiga ma isi vaega.(Ata 3d).
Na matou suʻesuʻeina foʻi itu e fesoʻotaʻi faʻatasi i le PACT.O le PACT o lo'o i ai vaega e tolu o lo'o fa'atinoina, e lua o lo'o fa'asaoina ni vaega fa'amaufa'alua RNA-binding domains (dsRBD) ma le vaega lona tolu (fa'ailoga D3) o lo'o galue e fai ma fa'agaioiga o feso'ota'iga polotini.Ina ia suʻesuʻeina le malosi faʻapipiʻi lncRNA o vaega taʻitasi, na matou faia ni suiga se tolu na aveese ai vaega taʻitasi e tolu ma faia se suʻega in vitro RIP.O a matou faʻaiʻuga na faʻaalia ai o le tapeina o le vaega lona tolu (D3) o le PACT na faʻaitiitia ai ana fegalegaleaiga ma le DARS-AS1 (e 0.11-faʻatusa pe a faʻatusatusa i le PACT le atoatoa) pe a faʻatusatusa i isi suiga e lua (Fig. 3h), na faʻaalia ai o le faʻamalolo. o D3 fegalegaleai ma DARS.-AC1.Faʻatasi, o nei taunuʻuga o loʻo fautua mai ai o fegalegaleaiga i le va o le DARS-AS1 ma le PACT e mafai ona tupu muamua e ala i le 3' pito o DARS-AS1 ma le D3 domain o le PACT.
Na matou maitauina o le DARS-AS1 e leai se aoga i luga o le PACT expression ma le PACT e leai se aoga i DARS-AS1 (Faʻaopoopo Ata 3c).Ona matou suʻesuʻeina lea o le aʻafiaga o le PACT knockdown i luga o le tuputupu aʻe o sela.I le faʻatusatusaina o le DARS-AS1, o sela faʻapitoa na faʻatupulaia 1.5-3 taimi vave pe a paʻu i lalo PACT (Faʻaopoopo Ata 3d).O faʻaiʻuga o le suʻesuʻega o le colony na faʻaalia ai o sela na fausia ai le 2-3-fold colonies ina ua maeʻa togafitiga shRNA ma le PACT (Faʻaopoopo Ata 3e).Ina ia faʻataʻitaʻia pe faʻatulafonoina e le DARS-AS1 le faʻateleina o le cell e ala i le PACT, matou te faʻatupuina sela SW620 e sili atu le faʻaalia o le PACT, DARS-AS1, poʻo mea uma e lua.O le faʻaalia o le PACT na faʻaalia ai le faʻalavelave tele o le faʻateleina o le cell (Ata 3i).E ui o le overexpression a le DARS-AS1 i le tasi na matua faʻateleina le faʻateleina o le cell, e leai se eseesega tele i le tuputupu aʻe o sela o loʻo faʻaalia le DARS-AS1 ma le PACT.O nei faʻaiʻuga e faʻaalia ai e mafai e le PACT ona faʻafefe le faʻateleina o le faʻateleina e mafua mai i le faʻaalia o le DARS-AS1.
Talu ai ona o itulagi eseese o DARS-AS1 e eseese le malosi o le PACT, matou te suʻesuʻeina a latou aʻafiaga i luga o le faʻalauteleina o le cell e ala i le faʻaalia o le DARS-AS1 vaega.Pe a faʻatusatusa i isi vaega e lua, o le DARS-AS1 na sili atu ona faʻaalia i le 3' end (384-768 nt), o le vaega autu o le PACT i DARS-AS1, lea e sili ona maualuga le malosi e faʻaosofia ai le faʻalauteleina o le cell (Fig 3j).O nei faʻaiʻuga o loʻo faʻaalia ai se fesoʻotaʻiga lelei i le va o le gafatia faʻamalosi ma galuega faʻaola ole DARS-AS1.
Ua lipotia mai le PACT o se porotini pro-apoptotic19.O le mea lea, na matou suʻesuʻeina le aʻafiaga o DARS-AS1 ile apoptosis.E pei ona faʻamoemoeina, o le tuʻituʻi o le DARS-AS1 na matua faʻapupulaina ai le paʻu o le PARP i sela SW620 ma faʻateleina le faʻatusatusaina o sela faʻapipiʻi V-positive i SW620, HCT116, HepG2, ma MBA-MD-231 laina sela (Fig 3k).3).3f-h), o loʻo faʻaalia ai o le anti-apoptotic aafiaga o le DARS-AS1 i sela o le kanesa e faʻafeagai ma le apoptosis-inducing function of PACT.Faʻatasi, o nei taunuʻuga o loʻo fautua mai ai o le faiga o le DARS-AS1 oncogenic galuega atonu e ala i le faʻasaina o le PACT galuega.
Na sosoo ai, na matou suʻesuʻeina le aʻafiaga o galuega a le DARS-AS1-PACT association.Ua lipotia mai le PACT e faʻagaoioia PKR e ala i fegalegaleaiga tuusaʻo, lea e faʻaleleia ai le eIF2α phosphorylation, mafua ai le faʻaliliuina o le tapeina ma le apoptosis17.Muamua, matou suʻesuʻeina pe aʻafia le DARS-AS1 i le faʻaogaina o le telefoni feaveaʻi o PACT ma PKR.Confocal fluorescence microscopy na faʻaalia ai o le PACT ma le PKR na matua faʻapipiʻiina i sela SW620 faʻatasi ai ma le averesi o le faʻasologa o le Pearson o le 0.72.I le taimi nei, o le overexpression o le DARS-AS1 na matua faʻaitiitia ai le PACT ma le PKR co-localization (o lona uiga o le Pearson correlation coefficient 0.61) (Ata 4a).Ina ia suʻesuʻe pe mafai e le DARS-AS1 ona faʻaogaina le fegalegaleaiga PACT-PKR, matou te faia se suʻesuʻega faʻatasi (co-IP) faʻatasi ma le anti-PACT antibody i SW620 cell lysates.O le PKR na matua fa'atamaoaigaina i le anti-PACT i totonu o sela e pulea, a'o le toe fa'aleleia o le PKR na fa'aititia tele i lysates mai sela e fa'aalia ai le DARS-AS1 (Fig. 4b).Fa'amama fa'ailoga PACT ma PKR sa fa'aogaina mo su'esu'ega fa'amauina o porotini in vitro.E tusa ai ma lea, oi latou na tuʻuina atu le DARS-AS1 ae leai se RNA pulea na faʻaalia le taofiofia o fegalegaleaiga PACT-PKR (Ata 4c).O faʻaiʻuga uma na faʻaalia ai o le DARS-AS1 na faʻalavelaveina le PACT ma le PKR fesoʻotaʻiga.
a Co-localization o PACT ma PKR i sela pulea po o sela overexpressing DARS-AS1 sa matauina e faaaoga confocal fluorescence microscopy.Na pisia le nuclei i le DAPI.Fa'amaumauga fa'amaumauga na maua mai ata e 16.b Co-immunoprecipitation (co-IP) faʻaaogaina anti-PACT antibody i lysates sela o le pulea SW620 sela poʻo sela ova le faʻaalia DARS-AS1.c Fa'ailoga PACT, fa'amamāina PKR ma fa'asalalau i totonu o le vitro fa'atasi ma le DARS-AS1 po'o le RNA fa'atauemu na fa'atupuina mo su'esu'ega fa'amauina o porotini in vitro.Anti-flag antibodies na faʻaaogaina mo le immunoprecipitation.d Immunoblots faʻatasi ai ma faʻamaʻi faʻaalia na faia i SW620 ma HCT116 sela na faʻafeiloaʻi ma le pulea shRNA poʻo DARS-AS1-shRNA sosoo ai ma le matelaina o le toto.e DARS-AS1 tulaga faʻaalia na suia ai le lagona feaveaʻi i le thapsigargin.SW620 sela na faʻafeiloaʻi ma DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 overexpression plasmid poʻo le pulea plasmid.O sela na togafitia i le thapsigargin mo le 48 itula ma faʻamautu le faʻaogaina o le sela e faʻaaoga ai le MTS reagent.f In vitro fa'aliliuina DARS-AS1 po'o le dummy RNA ma fa'amamāina PACT sa fa'aogaina mo le in vitro activation assay ma immunoblot detection.g Immunoblots fa'aaogaina nei fa'ama'i sa faia i luga o sela SW620-ctrl (agavale) po'o sela o lo'o fa'aalia le mutants PKR (taumatau).O nei sela na faʻafeiloaʻi ma le pulea shRNA poʻo DARS-AS1-shRNA sosoo ai ma le matelaina o le toto.h Flow cytometry na faʻaalia ai o le le faʻaaogaina o le mutant PKR na totogi mo DARS-AS1-apoptosis i totonu o sela SW620.i Immunoblots fa'atasi ai ma fa'ama'i fa'ailoa sa faia i sela SW620 (agavale) po'o le HCT116 (taumatau).O sela o lo'o a'afia i le pulea o le shRNA po'o le DARS-AS1 shRNA o lo'o le maua le serum ma fa'aopoopoina i le 100 nM PKR C16 inhibitor po'o le DMSO.Fua fua = 5 µm.O fa'amaumauga o lo'o fa'aalia o le averesi ± fa'asologa masani o su'ega se tolu.* p ≤ 0.05 su'ega-t a le tamaititi e lua-si'u.
E masani ona talitonu o le taimi lava e fegalegaleai ai le PACT ma le PKR17, e mafai ona faʻaosofia le phosphorylation PKR i Thr451.O a matou taunuʻuga na faʻaalia ai o le maualuga o le PKR phosphorylation na matua maualuga lava i le DARS-AS1 knockdown cell pe a maeʻa le matelaina o le toto (Fig. 4d and Supplementary Fig. 4a).E tusa ai ma lea, na matou iloa ai o le phosphorylation o le eIF2α, le autu autu o le PKR, na matua faateleina foi e le DARS-AS1 shRNA (Fig. 4d ma le Faʻaopoopoga Ata 4a).Thapsigargin o se faʻamaʻi ER e mafua ai ona faʻasaʻoloto e le ER Ca2 +.Togafitiga ma le thapsigargin ua lipotia mai e faʻaosofia ai le faʻaaliga ma le faʻagaoioia o le PACT, lea e faʻafesoʻotaʻi atili ai ma faʻagaoioia PKR, e oʻo atu ai i le apoptosis e ala i le faʻateleina o le eIF2α phosphorylation 18,61.O iinei, na matou faʻaogaina ai le thapsigargin e fai ma faʻamalosi o le auala PACT / PKR e suʻesuʻe pe mafai e DARS-AS1 ona fesoasoani i sela e faʻatoʻilaloina le faʻalavelave e ala i le taofia o le auala PACT / PKR.Na matou matauina o le maualuga o le faʻamatalaga DARS-AS1 e fesoʻotaʻi lelei ma le tetee atu i le thapsigargin.O sela SW620 o loʻo faʻaalia le DARS-AS1 na sili atu ona ola pe a togafitia i le thapsigargin, ae o sela ma DARS-AS1 knockdown na sili atu ona faigofie (Fig. 4e).E tusa ai ma nei taunuuga, o le faʻaupuga o le DARS-AS1 na faʻaititia ai le thapsigargin-induced PKR phosphorylation (Faʻaopoopo Ata 4b).I se faʻatusatusaga, ina ua maeʻa togafitiga thapsigargin, PKR ma eIF2α sa phosphorylated i se tulaga maualuga atu i le DARS-AS1 knockdown cell pe a faʻatusatusa i sela pulea (Faʻaopoopo Ata 4b).O le mea e mataʻina ai, o le thapsigargin na faʻaosoina le faʻaaliga DARS-AS1 i se fua faʻalagolago, lea e mafai ona faʻaalia ai se galuega faʻamalosi a le DARS-AS1 (Faʻaopoopo Ata 4c).E le gata i lea, na matou faia suʻega faʻamalosia in vitro e faʻamaonia ai nei faʻamatalaga.I se faapuupuuga, o le PKR na faʻamamāina mai cell lysates e faʻaaoga ai se anti-PKR antibody, ona faʻapipiʻiina lea i le PACT recombinant ma le DARS-AS1 na tusia i le vitro.Ina ua maeʻa le faʻaogaina o le enzymatic, na maua le phospho-PKR e faʻaaoga ai le WB.O a matou taunuʻuga na faʻaalia ai o le PKR phosphorylation na matua faʻalavelaveina e DARS-AS1, ae le o le pulea o le RNA (Ata 4f).O nei faʻaiʻuga in vitro ma in vivo o loʻo taʻu mai ai o le DARS-AS1 e faʻalavelaveina le faʻagaioiina o PKR-mediated PACT.I le taimi lava e tasi, na matou matauina foi le faʻaitiitia o le toe faʻaleleia o le PACT i le i ai o DARS-AS1 (Ata 4f).O lenei faʻaiʻuga e ogatasi ma faʻaiʻuga o le in vitro protein binding assay (Ata 4c) ma toe faʻaalia ai le poloka o galuega a DARS-AS1 mo le PACT-PKR association.
Ser246 ma Ser287 i le D3 vaega o le PACT e manaʻomia mo le faʻagaioiina o PKR i lalo o le faʻalavelave faʻapitoa.O le suitulaga o serine toega se lua mo alanine na maua ai le mutant PACT (mutD), lea na faʻagaoioia PKR i le leai o se faʻalavelave, ma suia mo le alanine (mutA) faʻaliliuina le maliega.Talu ai ua matou faʻaalia le taua o lenei vaega i fesoʻotaʻiga tuusaʻo ma DARS-AS1, matou te faia nei lua PACT mutants e faʻataʻitaʻi pe mafai foi ona aʻafia nei toega i fegalegaleaiga ma DARS-AS1.O le mea e malie ai, o mutants uma e lua na leiloa le mafai ona fusifusia i le DARS-AS1 (Faʻaopoopo Fig. 4d), faʻapea o le fausaga atoa o le PACT protein atonu e manaʻomia mo fegalegaleaiga lelei ma DARS-AS1.
E le gata i lea, oa tatou taunuuga foi e fautua mai ai o le DARS-AS1-shRNA-faʻatupuina faʻalavelave o le faʻateleina o le cell e mafai ona toe faʻafoʻisia i se vaega e ala i le soona faʻaalia o le PACT mutant (PACTmutA) poʻo se mutant PKR (PKRmut) (Fig Faaopoopo 4e. e).O le tele o faʻamatalaga o mutants pule-leaga PKR na faʻaititia ai le PKR phosphorylation faʻaosoina e DARS-AS1 knockdown faʻapea foʻi ma le eIF2α phosphorylation i sela faʻaleagaina serum (Fig. 4g).O le mea e sili atu ona taua, o le tele o sela apoptotic na faʻaosoina e le DARS-AS1 knockdown na faʻaititia foʻi i sela o loʻo faʻaalia PKRmut (Fig. 4h ma le Faʻaopoopo Fig. 4g).O le faʻasaina o le PKR kinase gaioiga e faʻaleagaina ai foi le galuega a le DARS-AS1, ona o faʻaiʻuga na faʻaalia ai o le tuʻituʻi o DARS-AS1 e seasea faʻaosoina le PKR ma le eIF2α phosphorylation pe a togafitia sela i le PKR-specific C16 inhibitor (Fig. 4i ma le Faʻaopoopoga Ata 4h).).Faʻatasi, o matou faʻaiʻuga o loʻo fautua mai ai o le DARS-AS1 e faʻateleina le faʻateleina o le cell, a itiiti ifo i se vaega, e ala i le faʻasaina o le faʻagaioiina o le PKR-mediated PACT.
Ina ia suʻesuʻe atili le matafaioi a le DARS-AS1 i le tumorigenesis, matou te faia i vivo faʻataʻitaʻiga e faʻaaoga ai le xenograft faʻataʻitaʻiga. I'uga e fa'aalia ai o le tu'itu'i o le DARS-AS1 na matua fa'aitiitia ai le tuputupu a'e o le toto i isumu (p value <0.0001) (Fig. 5a). I'uga e fa'aalia ai o le tu'itu'i o le DARS-AS1 na matua fa'aitiitia ai le tuputupu a'e o le toto i isumu (p value <0.0001) (Fig. 5a). Результати показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (aso. 5а). O faʻaiʻuga e faʻaalia ai o le tuʻituʻi o le DARS-AS1 e matua faʻaitiitia ai le tuputupu aʻe o le toto i isumu (p value <0.0001) (Ata 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 众< 0.0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результати показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (ris. 5а). O faʻaiʻuga na faʻaalia ai o le tuʻituʻi o le DARS-AS1 na faʻaitiitia ai le tuputupu aʻe o le toto i isumu (p value <0.0001) (Ata 5a).O le mea lea, i le DARS-AS1 knockdown group, sa i ai se faʻaititia tele o le maualuga o le tumo e tusa ma le 72.9% ma le uiga o le tumo e tusa ma le 87.8% (Ata 5b-d).O nei faʻaiʻuga e faʻaalia malosi ai e mafai e le DARS-AS1 ona faʻateleina le faʻatupulaia o le tumo i vivo.
Aafiaga o faʻasalalauga DARS-AS1 tuʻituʻi i luga ole oncogenesis colorectal i isumu le lavalava.O pi'o o le tuputupu a'e (a), lapo'a (b), mamafa (c), ma ata o le tuma (d) o lo'o fa'aalia.Fa'ailoga sese e fai ma sui o ± SEM. n = 10. ****p <0.0001, i le su'ega t a Tamaiti e lua-si'u. n = 10. ****p <0.0001, i le su'ega t a Tamaiti e lua-si'u. n = 10. ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 su'ega-t a le Tamaititia'i si'usi lua.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 su'ega-t a Tamaiti aoga e lua-si'u.e Kaplan-Meier suʻesuʻeina le fesoʻotaʻiga i le va o le faʻaaliga o le DARS-AS1 ma le ola atoa i tagata mamaʻi ma UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, ma LGG.Tulaga maualuga o faʻamatalaga DARS-AS1 i tagata gasegase sa i luga ole 50%;o le tulaga maualalo o le DARS-AS1 faʻamatalaga i tagata gasegase sa i lalo ole 50%.p-values ​​na fuafuaina e faʻaaoga ai le suʻega o le log rank.f Fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga lea e fa'atonutonu ai e le DARS-AS1 le ala PACT-PKR ma le tupu a'e o le tuma.
Ina ia malamalama atili i le aʻafiaga o le falemaʻi o DARS-AS1, na matou suʻesuʻeina le fesoʻotaʻiga i le va o lona faʻaaliga ma le ola maʻi.I le suʻesuʻeina o faʻamaumauga a le TCGA, na matou iloa ai o le maualuga o le DARS-AS1 faʻamatalaga e fesoʻotaʻi ma le uveal melanoma (UVM), renal chromophobia (KICH), renal papillary cell carcinoma (KIRP), mesothelioma (MESO), multiplex.O le maualalo o le ola na matuaʻi fesoʻotaʻi ma le glioblastoma morphosis (GBM) ma tagata mamaʻi e maualalo le togi o le faiʻai glioma (LGG) (Ata 5e).O nei fa'ai'uga e fa'ailoa mai ai e mafai e le DARS-AS1 ona faia se sao taua i le alualu i luma ole tumo ile falema'i ma e ono avea ma se fa'ailoga fa'apitoa fa'apitoa ile tele o kanesa.
I lenei su'esu'ega, i le fa'aaogaina o su'esu'ega fa'atino CRISPRi tetele, na matou iloa ai o le DARS-AS1 lncRNA e fa'ato'ilaloina le fa'amamafa o le kanesa e ala i le fa'atonutonuina o tali fa'alavelave fa'apitoa e lua, PACT ma PKR.E ala i le fegalegaleai saʻo ma le PACT, DARS-AS1 faʻalavelaveina le faʻaogaina o le PKR-mediated PACT, ma puipuia ai le apoptotic cell death ma faʻateleina le faʻateleina o le cell (Fig. 5f).O le faʻatonutonuina o le DARS-AS1 ua matauina i le tele o ituaiga o kanesa, e taʻu mai ai o lana galuega o le faʻalauteleina o le ola o le kanesa i lalo o tulaga faʻalavelave e mafai ona faʻaogaina lautele i le tele o ituaiga o kanesa.
PACT ua faailoaina o se PKR activator protein, ma PACT-mediated PKR activation e taua tele i le faʻalavelave tali e ala i le faʻatonutonuina o tusitusiga, faʻaliliuga, apoptosis, ma isi gaioiga taua tele62.Mo le tele o tausaga, ua faia taumafaiga e malamalama i le faʻatonuga o le kanesa o le PACT-PKR cascade.O iinei, o la matou suʻesuʻega na faʻaalia ai se faiga eseʻese o le faʻatonutonuina o le PACT-PKR i sela o le kanesa e ala i le cellular lncRNA DARS-AS1, lea e faʻapipiʻi saʻo i le PACT, poloka PACT-PKR fegalegaleaiga, faʻalavelaveina le faʻagaioiina o le PKR ma le eIF2α phosphorylation, ma faʻafefe ai apoptosis faʻamalosia ma fa'aosofia le fa'ateleina o le kanesa.sela.O lenei su'esu'ega ua fa'amalamalamaina ai le lncRNA fa'amoemoe mo le fa'ama'i ma togafitiga o le kanesa.
O a matou faʻamatalaga na faʻaalia ai o le tuʻituʻi o le DARS-AS1 e faʻaalia ai sela i le matelaina o le toto ma se faʻaopoopoga taua i le phosphorylated PKR ma le eIF2α.O nei faʻaiʻuga e faʻaalia ai o le DARS-AS1 e faʻamalosia le ola o le kanesa i lalo o tulaga faigata e ala i le taofia o le PACT / PKR.E tele isi RNA e le faʻamaonia, e pei o le ASPACT ma le nc886, o loʻo aʻafia foi i le PACT / PKR axis e ala i le faʻatonutonuina o le PACT48 mRNA poʻo le faʻatonutonuina o le autophosphorylation e ala i le fusia i PKR49,50,64.Faatasi ai ma i latou, DARS-AS1 galue o se faʻalavelave o le PACT-PKR asosi.O lenei suʻesuʻega e faʻatamaoaigaina ai lo tatou malamalama i le PACT/PKR axis regulation ma le matafaioi a lncRNAs i tali faʻalavelave.
O le PACT o lo'o iai vaega eseese e tolu.O muamua muamua e lua dsRBDs ua lava e ausia ai le maualuga o le fusifusia o le PACT i le PKR, ae o le vaega lona tolu (D3) e manaʻomia mo le faʻagaioiina o PKR in vitro ma in vivo.O a matou suʻesuʻega na faʻaalia ai o le DARS-AS1 e sili atu ona fegalegaleai ma le D3 domain (Fig. 3h).Ona o le tele o le lncRNA (768 nucleotides), o le DARS-AS1 o loʻo fusifusia i le D3 e mafai ona faʻalavelave faʻaletino le fegalegaleaiga i le va o le PACT domain o le dsRBD ma le PKR, ma taofia ai le mafutaga a PACT ma PKR.O suiga ole PACT na suia ai le Ser246 ma le Ser287 ile D3 ile alanine po'o le aspartate na fa'alavelaveina ai lona sootaga fa'atasi mo DARS-AS1, e fa'asino i le taua o le D3's atoa fausaga ma mea tau eletise i la latou mafutaga.E mana'omia nisi fa'amatalaga o lenei masini i le lumana'i, e fa'aaoga ai su'esu'ega sa'o ma'oti ma su'esu'ega a le PACT maualuga.
O suʻesuʻega muamua na lipotia mai o le DARS-AS1 e faʻamalosia le faʻalauteleina o le cell e ala i le tele o masini51,52,53.I se tasi faʻataʻitaʻiga, na matauina e le au suʻesuʻe o le DARS-AS1 na faʻatulafonoina lona antisense protein-encoding DARS gene e ala i le tulimataʻiina o le miP-194-5p i sela o le kanesa fatugaʻo.Ae ui i lea, i le suʻesuʻega o loʻo i ai nei, o le tuʻituʻi o le DARS-AS1 e itiiti sona aʻafiaga i le faʻasologa o le DARS i le tele o ituaiga o kanesa, e aofia ai le itiiti ifo o le colorectal, susu, ma le ate.Talu ai ona o lncRNAs e fa'aalia mamanu fa'aaliga fa'apitoa i sela ma aano, e le mafai ona fa'asaoina faiga fa'atino i ituaiga o kanesa, e ono fesoasoani i lenei fa'aletonu i le va o a tatou su'esu'ega ma su'esu'ega muamua o kanesa eseese.E manaʻomia ni suʻesuʻega faʻapitoa e faʻamalamalama ai auala faʻapitoa o faʻagasologa o le physiological ma pathological.
O se suʻesuʻega o faʻamatalaga faʻapitoa na faʻaalia ai o le faʻamatalaga o le DARS-AS1 i tuma e fesoʻotaʻi faʻatasi ma le ola o tagata gasegase o le kanesa, lea e vaʻaia ai le taua o le DARS-AS1 / PACT / PKR axis i le kanesa.I le faaiuga, o la matou suʻesuʻega o loʻo faʻaalia ai o le DARS-AS1 o se faʻatonuga o le PACT / PKR faʻailoga axis, faʻateleina le faʻalauteleina o le kanesa, ma faʻalavelaveina apoptosis i le taimi o le faʻalavelave faʻalavelave, lea e maua ai se isi laina o suʻesuʻega ma e fiafia mo suʻesuʻega i le lumanaʻi i togafitiga faʻapitoa. .
O laina telefoni a tagata SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 ma HEK293T na maua mai le National Cell Line Resource Infrastructure i Saina.O sela uma na tausia ile DMEM medium (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) faʻaopoopo i le 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) ma le 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) ile 37 ° C, 5% CO2.incubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (phosphorus S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (phosphorus S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);isumu masani IgG, CST (5415S);lapiti masani IgG, CST (2729S).Antibodies sa fa'afefeteina 1:1000 i le PBST mo Western blotting ma 1:100 mo IP.
sgRNAs na atiaʻe e faʻaaoga ai se meafaigaluega avanoa lautele e taʻua CRISPR-ERA66.Na matou fa'aogaina mea faigaluega fa'aletonu mo le atina'eina o le sgRNA ma le algorithm fa'atulagaina sgRNA fa'amauina nofoaga i le itulagi 3 kb.fa'atotonu i le TSS.O vaitaele o sgRNA oligonucleotides na faʻapipiʻiina i CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) ma faʻapipiʻi i totonu o le pgRNA plasmids (Addgene #44248).Ole aofaʻi ole 12 μg o le pgRNA plasmid faʻapitoa, 7.2 μg o le psPAX2 (Addgene #12260), ma le 4.8 μg o le pMD2.G (Addgene #12259) na faʻafeiloaʻi faʻatasi i le 5 x 106 HEK293T dishes e faʻaaoga ai le DNA 106 Transfection dishes sela (CWBIO, Beijing, Saina) mulimuli i faatonuga a le gaosi oloa.Sa aoina mai le supernatant o lo'o iai virusi ile 48 ma le 72 itula ina ua mae'a felauaiga ma fa'amama ile 0.45 µm faamama.Mo le suʻesuʻeina, SW620 sela o loʻo faʻaalia le dCas9/KRAB fusion protein na maua mai i le faʻaliliuina o siama.Suia SW620 sela na aʻafia i le potutusi o siama i faʻataʻitaʻiga faʻamaʻi tutoʻatasi e fa i se MOI o le 0.1-0.3 ma faʻataʻitaʻiina i le 2 μg / ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) mo le 2 aso.Mulimuli ane, na fa'atupuina sela mo le 18 aso i le in vitro fa'atasi ai ma le la'ititi o le faletusi o le 500 sela/sgRNA mo su'esu'ega.
Genomic DNA na maua mai e tusa ai ma faatonuga a le QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Siamani; 51183).I le aofaʻi, 100 μg o genomic DNA i le toe faia o meaola na faʻaaogaina e fausia ai le faletusi.O le vaega o le sgRNA na faʻateleina e le lua taamilosaga o le PCR ma fesoʻotaʻi atu i se paʻu.
O oloa PCR na faʻamamaina e faʻaaoga ai le NucleoSpin® gel ma le pusa faʻamamaina o le PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Siamani; 740609.250) ma faʻatusatusa i le faʻaaogaina o le Qubit ™ HS faʻapipiʻi faʻamaʻi pusi DNA (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
O le su'esu'ega MTS na fa'aaogaina e fua ai le fa'ateleina o sela.O sela sa fatu i totonu o papatusi 96-vaieli i le maualuga muamua o le 2000 sela / vaieli.O le numera faʻatusatusa o sela na fuaina i aso uma i le taimi faʻaalia mo le aofaʻi o 4-6 aso.Mo vaieli taʻitasi, 20 μl o le MTS reagent (Promega) na faʻafefeteina i le 100 μl o le DMEM, faʻapipiʻiina i sela mo le 4 h i le 37 ° C, ona fuaina lea o le OD490.
O le gafatia mo le tuputupu aʻe e leʻi faʻaogaina na maua e ala i le suʻesuʻeina o le faʻavaeina o spheres.I se faapuupuuga, 2000 sela na feaveai i le shRNA DARS-AS1 poʻo le pulea shRNA na faʻatupuina i le ultra low attachment microplates (Corning) faʻatasi ai ma suiga masani ile 4 aso.Na faitau spheroids pe a uma le 14 aso.500 sela na faʻafeiloaʻi ma le DARS-AS1 overexpression plasmid poʻo se plasmid pulea na faʻaaogaina mo le faʻaleleia o suʻega, a leai o le auala e le suia.
Na tusia le RNA e faʻaaoga ai le T7 RNA polymerase ma le biotin-16-UTP (Roche 1138908910) e tusa ai ma faʻatonuga a Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).O fa'amuamua o lo'o fa'aogaina iinei o lo'o lisiina i le Laulau Fa'aopoopo 4.
Protein-coding PACT poʻo PKR itulagi na faʻapipiʻiina ile pET15b (Addgene #73619) ma suia ile BL21(DE3).O siama na fa'a'a'ofu i le po i totonu o le LB na tu'uina atu i le ampicillin ona fa'afefeteina lea o le 100 fa'atasi ma le LB fou.Ina ua oʻo le OD600 o le alalaupapa i le 0.8, na faʻaopoopoina le 1 mM IPTG e faʻaosofia ai le faʻaalia o le protein.A maeʻa le faʻafefeteina i le po ma le lulu malu (250 rpm i le 20 ° C), na aoina le pellet cell e ala i le centrifugation (4000 rpm, 10 min, 4 ° C).Toe tu'u le pellet sela i lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) ma incubate i luga o le aisa mo 30 min, ona sonicate (15 min, 5 s on/off, i luga o le aisa) ma centrifuge (13,000). rpm)., 30 minu, 4°C).Ona utaina lea o le supernatant i luga o le resini Ni-NTA (QIAGEN) 3 taimi i le 4 ° C, fufulu 4 taimi i le paʻu fufulu (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) ma faʻafefe 3 taimi, ma le aofaʻi atoa. o le 10 ml eluent buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).Na fa'amauina le polotini mama e fa'aaoga ai le WB ma fa'amauina le fa'atonuga e fa'aaoga ai le Qubit™ protein assay kit (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP assays na faia e pei ona faʻamatalaina muamua, faʻatasi ai ma suiga.Fa'apuupuu, 1x RIP buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyses cytostatic 1 x 107 cocktail. (Roche, 1 mM DTT) ma centrifuge ile 13,000 rpm mo le 15 min ile 4 °C.O le supernatant na fa'auluina i le polotini A+G mageta lopa (Millipore) fa'atasi ma le 5 μg o le anti-PACT antibody (Abeam) po'o le IgG (CST).Na fufuluina fa'a 5 taimi ile 5x RIP buffer, ona fa'amama lea ile proteinase K (NEB).RNA na maua mai ma Trizol ma fuafuaina e le RT-qPCR.O lo'o tu'uina atu fa'amatalaga i le Siata Fa'aopoopo 5.
O le su'esu'ega RIP in vitro sa fa'atinoina e tusa ai ma se fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga RIP.Ole aofa'i ole 5 pmol ole RNA na fa'aliliuina ile in vitro sa fa'afefeteina 1x ile RIP buffer ma fa'amalo ile incubation ile 65°C mo le 5 minute sosoo ai ma le fa'alili lemu ile vevela potu.E tusa ma le 5 pmol o polotini PACT ua fa'aigoaina o le fu'a ua fa'amama mai le E. coli.Fa'asusu ile RNA toe fa'afo'i mo le 2 itula ile 4°C ma mulimuli i le fa'ata'ita'iga o lo'o i luga mo le su'esu'ega RIP mo le anti-fu'a IP.
Mo suʻesuʻega faʻaopoopoga RNA, 1 × 107 sela na faʻapipiʻiina i le 1xRIP buffer.Ina ua maeʻa le centrifugation i le 13,000 rpm mo le 15 min i le 4 ° C, o le supernatant na muaʻi togafitia i le 30 μl o streptavidin magnetic beads (Beckman) mo le 2 h i le 4 ° C.Ona tuʻuina atu lea o le lysate faʻamamaina i le fefete tRNA ma faʻapipiʻiina i le 40 pmol o le RNA toe faʻafoʻi i le po i le 4 ° C, ona faʻaopoopoina lea mo le isi 2 itula ma 20 μl o lopa mageta streptavidin fou na poloka i le BSA na faʻaopoopoina.Ole la'asaga fufulu e fa'a 4 taimi ile 5x RIP buffer ma le 4 taimi ile 1x RIP buffer.O polotini tutusa na faʻafefeteina i le biotin elution buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) ma vavae ese ile NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Ina ua mae'a le fa'ailoga siliva (Beyotime Biotechnology), o nisi fa'aili na vavae ese ma su'esu'eina e MS.
Sa faia su'esu'ega a le Co-IP e su'e ai le fegalegaleai i le va o le PACT ma le PKR.I se faapuupuuga, na saunia lysates sili e ala i le incubating 1 x 107 lysed sela i le 1 x RIP buffer sosoo ai ma le centrifugation i le 13,000 rpm mo le 15 minute i le 4 ° C.Lysates sa utaina i polotini A + G mageta lopa, faʻapipiʻi ma le 5 µg o le anti-PACT antibody, ma faʻasolo malie ile po ile 4°C.O loʻo fufuluina 3 taimi i le 5 × RIP buffer, faalua ma le 1 × RIP buffer ma faʻafefe i le 1 × SDS buffer.O le polotini toe maua na suʻesuʻeina e le SDS-PAGE gel ma iloa e le WB.
E lua pmol o le PACT ua fu'a ma le 1 pmol o le PKR na fa'amamaina mai le E. coli.Fa'asusu ile 1x RIP buffer ma fa'a'a'u ile 10 pmol ole RNA toe fa'afo'i mo le 2 itula ile 4°C.Ina ua mae'a, ona fa'a'ofuina lea i le polotini A+G magnetic bead-conjugated anti-labeled antibody mo se isi lua itula.Ona fufulu fa'afa lea o lopa i le 1x RIP buffer ma fa'afefete i le 1x SDS buffer.O le taunuuga o le PACT ma le PKR na maua e WB.

Taimi meli: Sep-23-2022