Faafetai mo le asiasi ile Nature.com.O le su'esu'ega o lo'o e fa'aogaina e fa'atapula'aina le lagolago a le CSS.Mo le poto sili ona lelei, matou te fautuaina oe e te faʻaogaina se suʻesuʻega fou (pe faʻamalo le Faiga Faʻatasi i Internet Explorer).I le taimi nei, ina ia mautinoa le faʻaauauina o le lagolago, matou te tuʻuina atu le saite e aunoa ma sitaili ma JavaScript.
Enzymatic fa'alatalata auala fa'atatau i esters fa'agaoioi po'o fa'asala phenoxy o lo'o fa'aaogaina lautele e fa'afanua proteomes subcellular ma feso'ota'iga polotini i sela ola.Ae ui i lea, o esters ua fa'agaoioia e fa'aitiitia le fa'agaoioiga, e mafua ai le lautele o le fa'ailoga, ma fa'atupu fa'ama'i fa'atupu fa'ama'i e mafai ona fa'alavelave i ala redox.O iinei matou te lipoti atu ai se auala e faʻatatau i le faʻaogaina o le photoactivation (PDPL) faʻapipiʻi e ala i le fesoʻotaʻiina o le miniSOG photosensitizer protein i se polotini e fiafia i ai.Fa'aosoina e le moli lanumoana ma fa'atonutonu e le taimi fa'aalia, e fa'atupuina le okesene singlet ona fa'asolo ai lea ole fa'ailoga ole histidine e le su'esu'ega aniline.Matou te faʻaalia lona faʻamaoni maualuga e ala i le faʻafanua proteome faʻapitoa o organelle.O se faʻatusatusaga faʻataʻitaʻiga o le PDPL ma TurboID o loʻo faʻaalia ai se faʻamatalaga faʻapitoa ma faʻamalamalamaga o le PDPL.Na sosoo ai, na matou faʻaogaina le PDPL i le faʻamaʻi faʻafesoʻotaʻi transcriptional coactivator BRD4 ma E3 Parkin ligase ma maua ai ni tagata e leʻi iloa muamua.E ala i le suʻesuʻeina o le overexpression, e lua mea e le o iloa, Ssu72 ma SNW1, na faʻamaonia mo Parkin, o lona faʻaleagaina o loʻo faʻatalanoaina e le auala ubiquitination-proteasome.
O le fa'ailoga sa'o o feso'ota'iga polotini o lo'o fa'avaeina ai le tele o faiga fa'avae telefoni feavea'i.O le mea lea, e sili atu le saʻo faʻafanua faʻafanua o fesoʻotaʻiga polotini o le a maua ai se faʻavae mole mo le faʻamalamalamaina o auala olaola, faʻamaʻi faʻamaʻi, ma faʻalavelaveina nei fegalegaleaiga mo faʻamoemoega togafitiga.I lenei tulaga, o auala e mafai ona iloa ai fegalegaleaiga faaletino i sela ola poʻo masini e matua manaʻomia.Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) ua leva ona fa'aaogaina e fa'ailoa ai pa'aga fusifusia o polotini o tului (POI).Faatasi ai ma le atinaʻeina o metotia proteomics quantitative, na faia ai le Bioplex3.0, o le tele o faʻamaumauga o fesoʻotaʻiga polotini e faʻavae ile AP-MS.E ui lava ina malosi tele le AP-MS, o le lysis cell ma le dilution step i le galuega e faʻaituau i fegalegaleaiga vaivai ma le tumau ma faʻafeiloaʻi mea faʻapitoa pe a maeʻa le lysis e pei o paga fefaʻatauaʻiga pepelo e leai se vaeluaga aʻo leʻi lysis.
Ina ia fo'ia nei fa'afitauli, ole amino acids e le masani ai (UAA) fa'atasi ai ma kulupu feso'ota'i fa'atasi ma fa'aigoa fa'aigoaina lata ane (PL) fa'avae (eg APEX ma BioID)5 ua fausia.E ui lava o le auala UAA ua faʻaaogaina ma le manuia i le tele o faʻaaliga ma tuʻuina atu faʻamatalaga i luga ole polotini faʻapipiʻi saʻo, e manaʻomia pea le faʻaleleia o le nofoaga faʻapipiʻi UAA.Ae sili atu le taua, o se auala faʻailoga stoichiometric e leai se faʻaliliuga faʻasolosolo o faʻailoga mea.I se faʻatusatusaga, o metotia PL enzymatic, e pei o le BioID method, faʻapipiʻi le biotin ligase i le POI7, lea e faʻagaoioia ai le biotin e fausia ai se biotinyl-AMP ester intermediate.O le enzyme lea e fa'apipi'iina ma fa'asa'oloto ai se biotin ua fa'agaoioia "cloud" lea e fa'ailoga ai toega o le lysine.Ae ui i lea, e manaʻomia e le BioID le sili atu i le 12 itula e maua ai se faʻailoga faʻailoga talafeagai, lea e taofia ai lona faʻaogaina ma le faʻatonuga faaletino.I le faʻaaogaina o le evolusione faʻatonu e faʻavae i luga o le fefete faʻaaliga, TurboID na mamanuina e faʻavae i luga o le BioID ina ia sili atu ona lelei, faʻatagaina lelei le faʻailogaina ma le biotin i totonu ole 10 minute, faʻatagaina le tele o faiga faʻamalosi e suʻesuʻeina.Talu ai ona o le TurboID e malosi tele ma e lava le maualuga o le biotin i totonu mo le faʻailoga maualalo, o le faʻailogaina o talaaga e avea ma faʻafitauli pe a manaʻomia le faʻailogaina maualuga ma le taimi e faʻaopopo ai le biotin mai fafo.E le gata i lea, o esters faʻagaoioia e le lelei le faʻaogaina (t1 / 2 ~ 5 min), lea e mafai ona taʻitaʻia ai se radius faʻailoga tele, aemaise lava pe a maeʻa le saturation o palatini lata ane ma le biotin 5. I se isi auala, o le fusuaga faʻasolosolo o inisinia ascorbate peroxidase (ie biotin- phenol radicals ma faʻatagaina le faʻailogaina o le polotini i totonu o le minute e tasi 9, 10. APEX e faʻaaogaina lautele e faʻamaonia ai le subcellular proteomes, membrane protein complexes, ma cytosolic signaling protein complexes11, 12. Ae ui i lea, o le manaʻomia mo le maualuga o le peroxides e mafai ona aʻafia ai redox proteins poʻo ala, faʻalavelave. faiga feavea'i.
O le mea lea, o se auala fou e mafai ona fa'atupuina ai le tele o fa'ailoga fa'ailoga-radius suppress species ma le maualuga fa'apitonu'u ma le fa'aletino sa'o e aunoa ma le fa'alavelave tele o auala feavea'i o le a avea ma fa'aopoopoga taua i metotia o lo'o iai. Faatasi ai ma ituaiga o meaola, o le okesene singlet na fafaguina o matou mafaufau ona o lona ola puupuu ma le faʻatapulaʻaina o le faʻasalalauga (t1/2 <0.6 µs i sela)13. Faatasi ai ma ituaiga o meaola, o le okesene singlet na fafaguina o matou mafaufau ona o lona ola puupuu ma le faʻatapulaʻaina o le faʻasalalauga (t1/2 <0.6 µs i sela)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограгници и ограгнича 1/6 мерднод из-за его короткого времени жизни и ограгнича 1/6 мердиф. Faatasi ai ma foliga galue, o le okesene singlet na tosina mai ai o matou mafaufau ona o lona olaga puupuu ma le faʻatapulaʻaina o le faʻasalalauga (t1/2 <0.6 µs i sela)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs）耶和华他们们们一上。 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограници и ограници и ограници / 6 злодный. Faatasi ai ma ituaiga gaogao, o le okesene singlet e tosina mai ai o tatou mafaufau ona o lona olaga puupuu ma le faatapulaaina o le faʻasalalauina (t1/2 <0.6 μs i sela).O le okesene singlet ua lipotia mai e faʻafefe faʻafuaseʻi le methionine, tyrosine, histidine ma tryptophan, ma avea ai ma polar 14,15 mo faʻapipiʻi i amine poʻo thiol faʻavae suʻesuʻega16,17.E ui lava na fa'aogaina le okesene e fa'aigoaina le vaega pito i lalo ole RNA, o ta'iala mo le toe fa'aaogaina o fa'ailoga vavalalata POI e tumau pea e le'i su'esu'eina.O iinei, matou te tuʻuina atu ai se faʻavae e taʻua o le photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL), lea matou te faʻaogaina ai le moli lanumoana e faʻamalamalamaina ai POI o loʻo faʻapipiʻiina ma se miniSOG photosensitizer ma faʻaosoina le gaosiga o le okesene e faʻamaʻi ai toega vavalalata, sosoo ai ma suiga o loʻo i ai amine e faʻafefe ai suʻega vailaʻau i totonu. sela ola vavalo..Sa matou fa'ata'ita'iina se vaega o su'esu'ega vaila'au e fa'atele ai le fa'ailoga fa'apitoa ma fa'ailoa nofoaga e fa'aleleia ai le fa'aogaina o le galuega fa'apolopolo matala.O se faʻatusatusaga faʻataʻitaʻiga o le PDPL ma TurboID o loʻo faʻaalia ai se faʻamatalaga faʻapitoa ma faʻamalamalamaga o le PDPL.Na matou faʻaogaina lenei auala i faʻailoga faʻapitoa o le subcellular proteome ma le faʻamaonia lautele o le proteome o paʻaga fusifusia mo le kanesa-epigenetic regulatory protein BRD4 ma le Parkinson's disease-related E3 ligase Parkin, lea na faʻamaonia ai le iloa ma le le iloa o fesoʻotaʻiga o porotini. fegalegaleaiga..O le malosi o le PDPL e iloa ai le E3 substrates i lavelave polotini tetele o loʻo faʻatusalia ai se tulaga e manaʻomia ai le amanaʻiaina o fusi faʻapitoa.E lua mea e le mailoa paka paka fa'asalalauina e ubiquitination-proteasome ua fa'amaonia i totonu.
Photodynamic therapy (PDT)19 ma le chromophore-assisted laser inactivation (CALI) 20, lea e faʻaosoina ai le malamalama faʻatasi ma photosensitizers e maua ai le okesene taʻitasi, e mafai ona faʻagataina polotini taulaʻi pe mafua ai le oti cell.Talu ai ona o le okesene singlet o se mea e sili ona fa'agaoioia ma se mamao fa'asalalau fa'ata'ita'i e tusa ma le 70 nm, e mafai ona fa'atonutonuina le fa'ama'iina fa'amatu'u fa'atapula'a i le photosensitizer.E faavae i luga o lenei manatu, na matou filifili e faʻaaoga le okesene singlet e ausia ai le faʻailoga vavalalata o faʻalavelave faʻalavelave i sela ola.Ua matou atia'e se PDPL chemoproteomic approach e fa'ataunu'uina ai galuega e fa: (1) e fa'atupuina le fa'atupuina o le okesene ta'avale e tutusa ma le PL enzymatic approach;(2) tu'uina atu le fa'ailoga ua fa'amalieina i le taimi e amata ai;(3) e ala i suiga (4) Aloese mai le fa'aogaina o mea fa'atosina (pei o le biotin) e fa'aitiitia ai le talaaga, po'o le fa'aogaina o mea fa'alavelave fa'afuase'i (e pei o peroxides) e fa'aitiitia ai le fa'alavelaveina o le si'osi'omaga.
Photosensitizers e mafai ona vaevaeina i ni vaega se lua e aofia ai fluorophores mamafa mole mole laiti (eg rose bengal, methylene blue)22 ma palatini laiti fa'aigoaina fa'a kenera (eg miniSOG, KillerRed)23.Ina ia ausia se mamanu faʻapitoa, na matou atiina ae le faʻavae muamua o le PDPL e ala i le faʻaopoopoina o polotini photosensitizer (PS) i POI24,25 (Ata 1a).Pe a faʻafefe i le moli lanumoana, o le okesene singlet e faʻamaʻiina ai toega nucleophilic amino acid proximal, e mafua ai se polarity umpolung e electrophilic ma e mafai ona toe tali atu i le amine probe nucleophiles16,17.O le su'esu'ega ua mamanuina ma se au alkyne e mafai ai ona kiliki le kemisi ma toso i lalo mo le LC / MS / MS uiga.
Faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga o le faʻailogaina o mea faʻapipiʻi protein faʻasalalau e miniSOG.Pe a faʻaalia i le malamalama lanumoana, o sela e faʻaalia ai le miniSOG-POI e faʻatupuina le okesene taʻitasi, lea e suia ai palatini fegalegaleai ae le o polotini e le fusifusia.O mea fa'alotoifale o le photooxidation e fa'alavelaveina e fa'ailoga fa'asalalau o le su'esu'ega vaila'au amine e fa'atupu ai fa'aopoopo fa'atasi.Ole vaega ole alkynyl ile su'esu'ega kemisi e mafai ai ona kiliki le kemisi mo le fa'atamaoaigaina e ala ile toso i lalo soso'o ma le LC-MS/MS quantitation.e Fa'asologa o vaila'au o su'esu'ega amine 1-4.c Sui su'esu'e gel fe'avea'i o mitochondrial localized miniSOG-mediated proteomic markers fa'aogaina su'esu'ega 1-4 ma fa'atusatusaga fa'atatau e fa'atatau ile gel densitometry.O le fua fa'ailoga-i-tua'i o su'esu'ega vaila'au na su'esu'eina e fa'aaoga ai fa'ata'ita'iga le lelei e le aofia ai le moli lanumoana po'o le fa'aogaina o sela HEK293T e aunoa ma le fa'aaliga miniSOG.n = 2 fa'ata'ita'iga tuto'atasi biologically.O togi ta'itasi o lo'o fa'atusalia ai se fa'atusa o mea ola.d Su'esu'e ma fa'atatauina o le PDPL e fa'aaoga ai le su'esu'ega sili ona lelei 3 i le i ai po'o le leai o vaega PDPL fa'ailoa e pei o c.n = 3 fa'ata'ita'iga tuto'atasi biologically.O togi ta'itasi o lo'o fa'atusalia ai se fa'atusa o mea ola.O laina ogatotonu ma 'avaisa o lo'o fa'atusalia ai le uiga ma le ± fa'asologa masani.CBB: Coomassie Brilliant Blue.u Fa'ata'ita'iga fa'afeagai o le okesene ta'ito'atasi ma le pisia Si-DMA mūmū mamao.Fua fua: 10 µm.O fa'ata'ita'iga gel ma fa'ata'ita'iga fa'afememea'i na toe faia tuto'atasi pe a ma le fa'alua fa'atasi ma fa'ai'uga tutusa.
Na matou faʻataʻitaʻiina muamua le gafatia o le poto faʻatagata matutua miniSOG26 ma le KillerRed23, faʻaalia manino i le HEK293T, e faʻatalanoaina le faʻailogaina o le propargylamine o le proteome o se suʻega vailaʻau (Faʻaopoopo Ata 1a).Ole su'esu'ega ole gel na fa'aalia ai ole fa'aigoaina atoa ole puipuiga na maua ile fa'aogaina ole miniSOG ma le lanu moana lanumoana, ae leai se oloa fa'ailoga va'aia na matauina ile KillerRed.Ina ia faʻaleleia le fua faʻatatau-i-tuaʻi, ona matou suʻeina lea o se seti o suʻega vailaʻau o loʻo i ai le aniline (1 ma le 3), propylamine (2), poʻo le benzylamine (4).Na matou matauina o sela HEK293T lava latou na i ai se faʻailoga maualuga maualuga pe a faʻatusatusa i le leai o se moli lanumoana, masalo ona o le endogenous riboflavin photosensitizer, flavin mononucleotide (FMN) 27. O suʻesuʻega vailaʻau faʻavae Aniline 1 ma le 3 na tuʻuina atu ai le faʻamatalaga sili atu, faʻatasi ai ma le HEK293T o loʻo faʻaalia manino le miniSOG i le mitochondria faʻaalia le> 8-faʻateleina le faʻailoga mo le suʻega 3, ae o le suʻega 2 faʻaaogaina i le RNA-labeling method CAP-seq naʻo faʻaalia ~ 2.5- fa'ateleina fa'ailo gaugau, atonu e mafua ona o le eseese o mea e fiafia i ai i le va o le RNA ma le polotini (Ata 1b, c). O suʻesuʻega vailaʻau faʻavae Aniline 1 ma le 3 na tuʻuina atu ai le faʻamatalaga sili atu, faʻatasi ai ma le HEK293T o loʻo faʻaalia manino le miniSOG i le mitochondria faʻaalia le> 8-faʻateleina le faʻailoga mo le suʻega 3, ae o le suʻega 2 faʻaaogaina i le RNA-labeling method CAP-seq naʻo faʻaalia ~ 2.5- fa'ateleina fa'ailo gaugau, atonu e mafua ona o le eseese o mea e fiafia i ai i le va o le RNA ma le polotini (Ata 1b, c).O suʻesuʻega vailaʻau faʻavae Aniline 1 ma le 3 na faʻaalia ai le faʻamaonia sili atu: HEK293T, lea e faʻaalia ai le miniSOG i le mitochondria, e sili atu nai lo le 8 faʻateleina le faʻailoga mo le suʻega 3, ae o le suʻega 2, faʻaaogaina i le CAP-seq RNA faʻailoga, naʻo. fa'aalia ~ 2.5-fa'ailoga fa'atuputeleina, masalo ona o le eseese o mea e fiafia i ai i le va o le RNA ma le polotini (Fig. 1b, c).基于苯胺的化学探针1 和3 具有更好的特异性，HEK293T 在线粒体中稳定表达miniSOG，探针3 的信号增加> 8 倍，而用于RNA 标记方法CAP-seq 的探针2 仅显示~ 2.5-信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -信号增加，可能是由于RNAAniline-faʻavae vailaʻau suʻesuʻe 1 ma 3 sa sili atu ona patino, HEK293T stably faʻaalia miniSOG i mitochondria, ma le suʻesuʻega 3 na sili atu i le 8-faʻateleina le faʻailoga, aʻo suʻesuʻega 2 mo le CAP-seq RNA faʻailoga auala na faʻaalia ai na o le ~ 2.5 -faʻateleina faʻaopoopoga.i le faailo, masalo ona o le eseese o mea e fiafia i ai i le va o le RNA ma le polotini (Fig. 1b, c).E le gata i lea, o suʻesuʻega 3 isomers ma hydrazine probes (suʻega 5, 6, 7) na faʻataʻitaʻiina, faʻamaonia le faʻamaoniaina o le suʻega 3 (Faʻaopoopo Ata 1b, c).E faapena foi, i-gel fluorescence suʻesuʻega na faʻaalia ai isi faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga sili ona lelei: umi o le galu (460 nm), suʻesuʻega vailaʻau (1 mM), ma le taimi faʻafefe (20 min) (Faʻaopoopo Ata 2a-c).O le tuʻuina atu o soʻo se vaega poʻo se laʻasaga i le PDPL protocol na iʻu ai i le suiga tele o faʻailoga i tua (Fig. 1d).Fa'ailogaina, na matua fa'aitiitia le fa'ailogaina o polotini pe a iai le sodium azide po'o le trolox, lea e iloa e tineia ai le okesene ta'ito'atasi.O le i ai o le D2O, lea e iloa e faʻamautu le okesene singlet, faʻaleleia le faʻailoga faʻailoga.Ina ia suʻesuʻeina le sao o isi ituaiga o okesene faʻamalosi i le faʻaigoaina, na faʻaopoopoina le mannitol ma le vitamini C e faʻavae ai le faʻaogaina o le hydroxyl ma le superoxide radical scavengers, i le faasologa, 18, 29, ae e leʻi maua e faʻaitiitia ai le faʻailoga.Faʻaopoopoina o le H2O2, ae le o le faʻamalamalamaina, e leʻi iʻu i le faʻailogaina (Faʻaopoopo Ata 3a).O le faʻataʻitaʻiga o le okesene singlet felafolafoaʻi ma suʻega Si-DMA na faʻamaonia ai le i ai o le okesene singlet i le uaea HEK293T-miniSOG, ae le o le uluai uaea HEK293T.E le gata i lea, e le mafai e le mitoSOX Red ona iloa le gaosiga o le superoxide pe a maeʻa le faʻamalamalamaina (Fig. 1e ma le Faʻaopoopo Faʻamatalaga 3b) 30. O nei faʻamatalaga e matua fautua mai ai o le okesene singlet o le ituaiga autu o le okesene reactive e nafa ma le faʻailoga proteomic mulimuli ane.Cytotoxicity o le PDPL na suʻesuʻeina e aofia ai le lanu moana lanumoana ma suʻesuʻega vailaʻau, ma e leai se cytotoxicity taua na matauina (Faʻaopoopo Ata 4a).
Ina ia mafai ona suʻesuʻeina le faiga o le faʻailoga ma mafai ai ona faʻamaonia proteomic o palatini lavelave e faʻaaoga ai le LC-MS / MS, e manaʻomia muamua ona tatou iloa po o fea amino acids e faʻaleleia ma le delta mass o igoa suʻesuʻe.Methionine, histidine, tryptophan ma tyrosine ua lipotia mai e suia e le okesene singlet14,15.Matou te tuʻufaʻatasia le TOP-ABPP31 galuega faʻatasi ma le suʻesuʻega matala le faʻaituau na saunia e le FragPipe computing platform e faʻavae ile MSFragger32.Ina ua uma le suiga o le okesene singlet ma le faailogaina o su'esu'ega vaila'au, kiliki le kemisi sa faia i le fa'aogaina o le fa'aitiitiga o le biotin o lo'o i ai se so'otaga fa'apipi'i, soso'o ai ma le fa'alauteleina o le neutravidin ma le fa'ama'iina o le trypsin.O le peptide ua suia, o loʻo fusia pea i le resini, na faʻapipiʻiina mo le suʻesuʻega LC-MS / MS (Ata 2a ma Faʻamatalaga Faʻaopoopo 1).O se numera tele o suiga na tupu i totonu o le proteome ma sili atu i le 50 peptide map (PSM) matches lisi (Fig. 2b).O le mea e ofo ai, na matou matauina le suiga o le histidine, masalo ona o le maualuga o le gaioiga o le histidine oxidized agai i suʻega aniline nai lo isi amino acids.E tusa ai ma le faiga faʻasalalau o le histidine oxidation e ala i le okesene singlet, 21,33 o le faʻatulagaina o le delta-mass structure o +229 Da e fetaui ma le faʻapipiʻiina o le suʻesuʻega 3 ma le 2-oxo-histidine pe a maeʻa faʻamaʻi e lua, ae o le +247 Da o le oloa hydrolysis. o le +229 Da (Faaopoopo Ata 5).O le iloiloga o le fusi ole MS2 na faʻaalia ai le maualuga o le faʻamaoni o le faʻamaonia o le tele o le y ma le b ion, e aofia ai le faʻamaoniaina o mea faʻapipiʻi suiga (y ma le b) (Fig. 2c).O le suʻesuʻeina o faʻamatalaga o le faʻasologa faʻapitonuʻu o histidines faʻafouina PDPL na faʻaalia ai le faʻaogaina lelei o le faʻaogaina o mea laiti hydrophobic i ± 1 tulaga (Faʻaopoopo Ata 4b).I le averesi, 1.4 histidines na iloa i le porotini, ma o nofoaga o nei faailoga na fuafuaina e ala i le solvent accessible area (SASA) ma le suʻesuʻeina o le solvent (RSA) suʻesuʻega (Faʻaopoopo Ata 4c, d).
Ose galuega fa'aituau mo le su'esu'eina o le filifiliga o totoe e fa'aaoga ai le FragPipe computing platform e fa'amalosia e MSFragger.O lo'o fa'aogaina feso'ota'iga i le Kiliki kemisi e fa'ataga ai le photocleavage o peptides ua suia mai le resini streptavidin.Na fa'alauiloa se su'esu'ega e iloa ai le tele o suiga, fa'apea fo'i ma toega talafeagai.e Tofia le tele o suiga o loʻo tutupu i le proteome atoa.Peptide fa'afanua PSM.c MS2 fa'amatalaga fa'apitoa o nofoaga o le histidine ua suia i le su'esu'ega 3. E fai ma fa'ata'ita'iga fa'atusa, o le tali fa'atasi ma le su'esu'ega 3 fa'aopoopo +229.0938 Da i le amino acid ua suia.d Su'ega suiga na fa'aaogaina e su'e ai fa'ailoga PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) ma PRDX1 (H10A, H81A, H169A) na faʻafeiloaʻi faʻatasi ma plasmids wild-type mo le suʻeina o le Fuʻa.e O le peptide synthetic na tali atu i le miniSOG mama i luma o le suʻesuʻega 3 ma o oloa tutusa ma le Δm +247 ma le +229 sa maitauina i le LC-MS spectrum.f Fegalegaleaiga in vitro protein-to-protein faʻataʻitaʻiina i le miniSOG-6xHis-tag ma le anti-6xHis antibody.Antibiotin (streptavidin-HRP) ma le anti-mouse Western blot analysis of miniSOG-6xHis/anti-6xHis antibody complexes ua fa'ailogaina ile su'esu'ega 3, e fa'atatau ile taimi e fa'aalia ai le malamalama.Fa'ailoga mo polotini ta'itasi o lo'o fa'aalia i le mamafa mole mole tutusa: filifili mama LC antibody, filifili mamafa HC antibody.O nei fa'ata'ita'iga sa faia tuto'atasi pe a ma le fa'alua fa'atasi ma fa'ai'uga tutusa.
Mo fa'amaoniga fa'aolaola ole nofoaga fa'aigoaina, PRDX3 ma PRDX1 fa'ailoa ile tele spectrometry na suia mai le histidine ile alanine ma fa'atusatusa ile ituaiga vao i su'ega felauaiga.O taunuʻuga a le PDPL na faʻaalia ai o le suiga na faʻaitiitia ai le faʻailoga (Fig. 2d).I le taimi nei, o le peptide sequences na faʻaalia i le suʻesuʻega tatala na faʻapipiʻiina ma faʻaalia i vitro faʻatasi ai ma le miniSOG faʻamamaina i luma o le suʻega 3 ma le moli lanumoana, e maua ai oloa ma se suiga tele o + 247 ma + 229 Da pe a iloa e LC-MS (Fig). .2e).).Ina ia faʻataʻitaʻi pe mafai ona faʻailogaina le faʻaogaina o palatini vavalalata i vitro i le tali atu i le miniSOG photoactivation, na matou fuafuaina se suʻega vavalalata faʻapitoa e ala i fegalegaleaiga i le va o le miniSOG-6xHis protein ma se anti-His monoclonal antibody in vitro (Ata 2f).I lenei suʻesuʻega, na matou faʻamoemoeina le faʻailogaina o le antibody mamafa ma mama filifili ma miniSOG.O le mea moni, o le anti-mouse (iloa le mamafa ma le mama filifili o le anti-6xHis-labeled antibody) ma streptavidin Western blots na faʻaalia ai le biotinylation malosi o filifili mamafa ma mama.E le gata i lea, na matou matauina le miniSOG autobiotinylation ona o le 6xHis tag ma fesoʻotaʻiga i le va o filifili mama ma mamafa, lea e mafai ona fesoʻotaʻi ma le va o loʻo faʻamatalaina muamua i le va o le lysine ma le 2-oxo-histidine proximal tali.I le faaiuga, matou te faʻamaonia o le PDPL e suia le histidine i se auala faʻalagolago.
O la matou sini na sosoo ai o le faʻamalamalamaina o le subcellular proteome e faʻataʻitaʻi ai le faʻapitoa o le faʻailoga in situ.O le mea lea, matou te faʻaalia le miniSOG i totonu o le nucleus, mitochondrial matrix, poʻo fafo ER membrane o sela HEK293T (Fig 3a).Ole su'esu'ega ole gel na fa'aalia ai le tele o fa'ailoga fa'ailoga i nofoaga laiti e tolu fa'apea fo'i ma fa'ailoga eseese (Ata 3b).O suʻesuʻega faʻataʻitaʻiga o le fluorescence na faʻaalia ai le maualuga o le PDPL (Fig 3c).O le galuega a le PDPL na sosoʻo ai ma kiliki faʻatasi ma le rhodamine dyes e faʻailoa ai subcellular proteomes e faʻaaoga ai le microscopy fluorescence, ma faʻailoga PDPL na faʻapipiʻiina ma DAPI, mitochondrial trackers, poʻo ER trackers, faʻamaonia le maualuga o le faʻamaoni o le PDPL.Mo nofoaga e tolu o le organelle, o se faʻatusatusaga itu-i-itu o le PDPL ma TurboID faʻaaogaina avidin western blot na faʻaalia ai o le PDPL na faʻailogaina sili atu pe a faʻatusatusa ia latou taʻiala.I lalo o tulaga o le PDPL, ua aliali mai ai le tele o fusi faʻailoga, e faʻaalia ai le tele o polotini faʻaigoaina PDPL (Faʻaopoopo Ata 6a-d).
o se ata fa'atusa ole miniSOG-mediated organelle-specific proteome labeling.miniSOG e faʻatatau i le mitochondrial matrix e ala i le fusi i le N-terminal 23 amino acids o le tagata COX4 (mito-miniSOG), le nucleus e ala i le fusi i le H2B (nucleus-miniSOG), ma le Sec61β e ala i le itu cytoplasmic o le membrane ER (ER-miniSOG). ).O faʻamatalaga e aofia ai le faʻataʻitaʻiga o gel, faʻataʻitaʻiga faʻafefe, ma le tele o spectrometry.b Faʻatusa gel ata o faʻamatalaga PDPL faʻapitoa e tolu o organelle.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Fa'atusa fefiloi ata o sela HEK293T o lo'o fa'aalia mautu le miniSOG fa'atasi ai ma fa'asinomaga laiti eseese na maua e le antibody fa'ailoga V5 (mumu).O faʻailoga pito i lalo e faʻaaogaina mo le mitochondria ma le ER (lanu meamata).Ole galuega ole PDPL e aofia ai le suʻeina ole miniSOG (samasama) faʻaigoaina subcellular proteomes e faʻaaoga ai Cy3-azide kiliki kemisi.Fua fua: 10 µm.d Fuafua mauga o PDPL-tagged proteomes i okeni eseese ua fa'atatauina e le fa'ailogaina fa'atatau (n = 3 fa'ata'ita'iga tuto'atasi o meaola).Sa fa'aogaina le su'ega-t-t-tailed Student i luga o fanua mauga mu.HEK293T ituaiga vao na faʻaaogaina e fai ma pule le lelei. O polotini ua suia tele o lo'o fa'amamafaina i le mumu (p <0.05 ma le >2-fe'ese'esega o le malosi o le ion). O polotini ua suia tele o lo'o fa'amamafaina i le mumu (p <0.05 ma le >2-fe'ese'esega o le malosi o le ion). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). O polotini ua suia tele o lo'o fa'amamafaina i le mumu (p <0.05 ma le >2-fa'aiga le eseesega i le malosi o le ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). O polotini ua suia tele o lo'o fa'amamafaina i le mumu (p <0.05 ma le > 2-sa'iga eseesega i le malosi o le ionic).O palatini fa'atatau e taua mo HEK293T-miniSOG ae le taua mo HEK293T o lo'o fa'aalia i le lanu meamata.u Su'esu'ega fa'apitoa o fa'amaumauga proteomic mai fa'ata'ita'iga d.O le aofa'i o polotini taua fa'afuainumera i okeni ta'itasi ( togitogi mumu ma lanu meamata) o lo'o fa'ailoga i le pito i luga.O histograms o loʻo faʻaalia ai polotini o loʻo faʻaogaina i okeni e faʻavae i luga ole MitoCarta 3.0, suʻesuʻega GO ma A. Ting et al.tagata.Vaevae fa'amaumauga mo mitochondria, nuclei, ma ER.O nei fa'ata'ita'iga sa faia tuto'atasi pe a ma le fa'alua fa'atasi ma fa'ai'uga tutusa.O fa'amatalaga mata'utia o lo'o tu'uina atu i le tulaga o faila fa'amaumauga mata'utia.
Faʻamalosia e le gel ma faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga, faʻamaufaʻailoga e leai se faʻailoga na faʻaaogaina e faʻatusatusa ai le proteome ua iloa i totonu o okeni taʻitasi (Faʻamatalaga Faʻaopoopo 2).HEK293T e le'i fa'aliliuina na fa'aaogaina e fai ma pule le lelei e to'ese ai fa'ailoga pito i tua. Ole su'esu'ega ole mauga mu na fa'aalia ai polotini fa'atamaoaigaina tele (p <0.05 ma>2-gaiga ion intensity) fa'apea fo'i polotini ta'itasi e na'o laina fa'aalia miniSOG (Fig. 3d togi mumu ma lanu meamata). Ole su'esu'ega ole mauga mu na fa'aalia ai polotini fa'atamaoaigaina tele (p <0.05 ma>2-gaiga ion intensity) fa'apea fo'i polotini ta'itasi e na'o laina fa'aalia miniSOG (Fig. 3d togi mumu ma lanu meamata). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Ole su'esu'ega ole volcano na fa'aalia ai le fa'atamaoaigaina tele o polotini (p<0.05 ma> 2-fold ion intensity) fa'apea fo'i polotini ta'itasi e na'o laina miniSOG-fa'aalia (Fig. 3d, togi mumu ma lanu meamata).火山图分析显示出显着富集的蛋白质（p < 0.05 和>2 倍离子强度）以及仅存在于miniSOG 表达系中的单一蛋白质（图3d 红色和绿色点）。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Ole su'esu'ega ole volcano na fa'aalia ai polotini fa'atamaoaigaina tele (p<0.05 ma>2x ionic strength) fa'apea fo'i polotini ta'itasi na'o iai i le laina fa'aaliga miniSOG ( togitogi mumu ma lanu meamata i le Ata 3d).O le tuʻufaʻatasia o nei faʻamatalaga, na matou iloa ai le 1364, 461, ma le 911 faʻamaufaʻailoga taua faaniukilia, mitochondrial, ma ER o fafo membrane proteins, i le faasologa.Ina ia faʻavasega le saʻo o le organelle-localized PDPL, matou te faʻaogaina le MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) suʻesuʻega, ma A. Ting et al.o se seti faʻamaumauga8 na faʻaaogaina mo le mitochondria, nucleus, ma le ER e faʻataʻitaʻi ai le faʻapitoa o le organelle o polotini ua iloa, e fetaui ma le saʻo o le 73.4, 78.5, ma le 73.0% (Fig 3e).O le faʻapitoa o le PDPL e faʻamaonia ai o le PDPL o se meafaigaluega lelei mo le faʻailoaina o proteome faʻapitoa o organelle.Aemaise lava, o le suʻesuʻeina o le suʻesuʻega o le mitochondrial proteins na faʻaalia ai o le proteome na puʻeina na masani ona tufatufaina i le matrix ma totonu o le membrane (226 ma le 106, i le faasologa), e faʻatatau i le 91.7% (362) o le aofaʻi o faʻamatalaga mitochondrial proteins.o se maualuga maualuga o le PDPL na faʻamaonia atili (Faʻaopoopo Ata 7a).E faʻapea foʻi, suʻesuʻega subnuclear na faʻaalia ai o le proteome na puʻeina na masani ona tufatufaina i totonu o le nucleus, nucleoplasm, ma nucleolus (Faʻaopoopo Ata 7b).Nuclear proteomic analysis with a nuclear localization signal peptide (3xNLS) faʻaalia tutusa le saʻo i le H2B construct (Faʻaopoopo Ata 7c-h).Ina ia iloa le faʻapitoa o le faʻailoga PDPL, na filifilia ai le laminin faaniukilia A e avea o se mailei POI7 sili atu ona faʻaogaina.Ua faailoa mai e le PDPL 36 polotini ua matua'i fa'atamaoaigaina, lea e 12 polotini (30.0% e aofia ai le lamin A) sa fa'ailoa lelei le lamin A fa'afeso'ota'i polotini fa'ailoa mai e le String database, ma se pasene maualuga atu nai lo le BioID method (122 proteins) 28 o le 28. , 22.9 %) 7. O la matou metotia na iloa ai le itiiti ifo o polotini, masalo ona o le utiuti o nofoaga e fa'aigoaina, lea na mafai e ala i le sili atu o le okesene ta'aloga.O suʻesuʻega a le GO na faʻaalia ai o polotini faʻamaonia sa tele lava i totonu o le nucleoplasm (26), faʻamaʻi faaniukilia (10), membrane faaniukilia (9), ma pores faaniukilia (5).Fa'atasi, o nei polotini faaniukilia-localized na maua mo le 80% o polotini fa'atamaoaigaina, ma fa'aalia atili ai le fa'apitoa o le PDPL (Fa'aopoopo Ata 8a-d).
I le faʻamautuina o le malosi o le PDPL e faʻatino ai faʻailoga vavalalata i okeni, ona matou faʻataʻitaʻiina lea pe mafai ona faʻaogaina le PDPL e suʻesuʻe ai paaga faʻapipiʻi POI.Aemaise lava, na matou taumafai e faʻamalamalamaina le PDPL suʻesuʻega o polotini cytosolic, lea e manatu e sili atu le faigata o sini nai lo o latou membrane-localized counterparts ona o lo latou natura sili ona malosi.O le bromodomain ma le extraterminal (BET) protein BRD4 ua tosina mai ai lo tatou gauai mo lana matafaioi autu i faʻamaʻi eseese 35, 36 .O le lavelave na fausia e le BRD4 o se transcriptional coactivator ma o se faʻamoemoega togafitiga taua.E ala i le faʻatonutonuina o le faʻamatalaga o le c-myc ma le Wnt5a faʻaliliuga, o le BRD4 e manatu o se mea taua tele o le leukemia myeloid (AML), myeloma tele, Burkitt's lymphoma, kanesa colon ma faʻamaʻi inflammatory37,38.E le gata i lea, o nisi faʻamaʻi e faʻatatau i le BRD4 e faʻatonutonu ai viral ma cellular transcription, pei ole papillomavirus, HIV, ma le SARS-CoV-236,39.
Ina ia faʻafanua le fesoʻotaʻiga BRD4 e faʻaaoga ai le PDPL, matou tuʻufaʻatasia le miniSOG ma se N- poʻo C-terminal isoform ole BRD4.O taunu'uga proteomic na fa'aalia ai se maualuga maualuga o le fa'aogaina i le va o mea e lua (Fa'aopoopo Ata 9a).O le polotini faaniukilia ua iloa ma le miniSOG-H2B e aofia ai le 77.6% o polotini e fegalegaleai ma BRD4 (Faaopoopo Ata 9b).Ma, o taimi eseese o le faʻamalamalamaina (2, 5, 10, 20 min) na faʻaaogaina e faʻafetaui ai le faʻailoga faʻailoga (Fig. 4a ma faʻamatalaga faaopoopo 3).Matou te fa'ai'uga i taimi pu'upu'u, o le PDPL o le a fa'aigoaina tu'usa'o pa'aga tu'usa'o, a'o taimi uumi o le a aofia ai polotini fa'ailoa i taimi pupuu fa'ato'aga fa'apena fa'apea fo'i fa'ailoga fa'apitoa i fa'ailoga lavelave.O le mea moni, na matou maua le faʻaogaina malosi i le va o taimi lata ane (84.6% mo le 2 ma le 5 min; 87.7% mo le 5 ma le 10 min; 98.7% mo le 10 ma le 20 min) (Fig 4b ma le Faʻaopoopoga Ata 9c).I vaega fa'ata'ita'i uma, na matou maua e le gata o le BRD4 fa'ailoga a le tagata lava ia, ae o le tele o fa'amoemoe iloga e pei o le MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, ma le HMGB1 o lo'o fa'amauina i le fa'amaumauga o manoa.O le malosi o le ionic o nei sini e faʻatatau i le taimi faʻaalia (Fig. 4c ma le Faʻaopoopoga Ata 9d).O suʻesuʻega a le GO o polotini na faʻaalia i le 2-minute vaega na faʻaalia ai o polotini faʻamaonia na faʻaogaina i totonu o le nucleus ma sa aʻafia i le chromatin remodeling ma le RNA polymerase function.O le galuega mole mole o le polotini na faʻatamaoaigaina i le chromatin binding poʻo le transcriptional coactivation, e ogatasi ma le galuega BRD4 (Fig. 4d).O suʻesuʻega faʻafesoʻotaʻi faʻapipiʻi faʻamaumauga e faʻaogaina ai faʻamaumauga na faʻaalia ai se tulaga muamua o fesoʻotaʻiga le tuusao i le va o BRD4 ma HDAC aiga fesoʻotaʻiga faʻalavelave e pei ole SIN3A, NCOR2, BCOR, ma le SAP130 (Fig. 4e ma le Faʻaopoopo Fig. 9e), e ogatasi ma BRD4 ma HDAC fusifusia acetylated histones ..E le gata i lea, o sini sui na faailoa mai e le LC-MS / MS, e aofia ai le Sin3A, NSUN2, Fus, ma le SFPQ, na faʻamaonia e Western blotting (Fig. 4f).Talu ai nei, o le isoform puupuu o le BRD4 ua lipotia mai e fausia ai le nuclei ma le vai-suavai vaega vavaeeseina (LLPS) meatotino.O polotini fusifusia RNA Fus ma le SFPQ e fa'afesoota'i le LLPS o faiga fe'avea'i eseese ma ua fa'ailoa mai i'inei o palatini fa'amauina BRD4 e le'i fa'amauina.O le fegalegaleaiga i le va o le BRD4 ma le SFPQ na faʻamaonia e le co-immunoprecipitation (co-IP) faʻataʻitaʻiga (Ata 4g), faʻaalia se isi faiga mo le BRD4-mediated liquid-liquid phase separation e tatau ona suʻesuʻeina atili.Fa'atasi, o nei fa'ai'uga e fa'ailoa mai ai o le PDPL o se fa'avae lelei mo le fa'ailoaina o feso'ota'iga BRD4 fa'apea fo'i ma polotini fa'amau e le iloa.
se faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga o le miniSOG-mediated BRD4 faʻailoga vavalalata, taimi faʻaalia: 2, 5, 10, ma le 20 min.b O'i luga o polotini ua iloa i taimi eseese o le malamalama.O le fa'atamaoaigaina o porotini na fa'ailoaina ile HEK293T-miniSOG-BRD4 e taua tele fa'atusatusa ile HEK293T.c Malosi o le ion pe a fuaina le sui e le'i fa'ailogaina e iloa BRD4-fa'amauina polotini i le taimi fa'aalia.n = 3 fa'ata'ita'iga tuto'atasi biologically.O faʻamaumauga o loʻo tuʻuina atu o le mean ± standard deviation.d Gene ontological analysis (GO) o polotini ua iloa i le vaega 2-minute.O fa'aupuga muamua e sefulu GO o lo'o lisiina.E lanu pulu e tusa ai ma le vaega GO term, ma le tele o le pulu e fa'atusatusa i le numera o polotini e maua i taimi ta'itasi.u Su'esu'ega fa'asologa o polotini e fegalegaleai ma BRD4.O li'o samasama o le kelu tuusa'o ma o li'o efuefu o le vaega muamua lea o le kelu le tuusao.O laina mumu o lo'o fa'atusalia ai feso'ota'iga fa'ata'ita'i fa'ata'ita'i ae o laina lanumoana e fa'atusalia ai feso'ota'iga va'ai.f Sui BRD4 fa'amauina sini fa'ailoa i le LC-MS/MS na fa'amaonia e ala i Western blotting.g Co-immunoprecipitation experiments faʻamaonia le fegalegaleaiga i le va o le SFPQ ma le BRD4.O nei fa'ata'ita'iga sa faia tuto'atasi pe a ma le fa'alua fa'atasi ma fa'ai'uga tutusa.O fa'amatalaga mata'utia o lo'o tu'uina atu i le tulaga o faila fa'amaumauga mata'utia.
I le faaopoopo atu i le faailoaina o sini e le'i resitalaina POI, matou te manatu o le PDPL o le a talafeagai mo le faailoaina o substrates mo enzymes, lea e manaʻomia ai le faʻavasegaina o palatini faʻapipiʻi tuusaʻo i lavelave tetele e faʻamaonia ai mea e leʻi resitalaina.Parkin (fa'ailogaina e PARK2) o le E3 ligase ma suiga i le paka ua iloa e mafua ai le autosomal recessive juvenile Parkinson's disease (AR-JP)42.E le gata i lea, ua faʻamatalaina le pakaina e taua mo le mitophagy (mitochondrial autophagy) ma le aveeseina o ituaiga o okesene faʻafefe.Ae ui i lea, e ui lava ua faʻaalia le tele o vaega o paka, o le matafaioi a le paka i lenei faʻamaʻi e tumau pea le le manino.Ina ia faʻamatalaina ana mea e le faʻamaonia, na faʻataʻitaʻiina le PDPL e ala i le faʻaopoopoina o le miniSOG i le N- poʻo le C-terminus o paka.O sela na togafitia i le carbonyl cyanide proton transporter m-chlorophenylhydrazone (CCCP) e faʻagaoioi ai le pakaina e ala i le auala PINK1-Parkin.Pe a faʻatusatusa i matou BRD4 PDPL taunuʻuga, parkin N-terminus fusion na faʻaalia ai le tele o seti o polotini taulaʻi, e ui lava na aofia ai se vaega tele o le C-terminus (177 mai le 210) (Ata 5a, b ma Faʻamatalaga Faʻaopoopo 4).o le taunuuga e ogatasi ma lipoti e mafai ona fa'agaoioi e fa'ailoga N-terminal le Parkin44.O le mea e ofo ai, e naʻo le 18 polotini faʻapipiʻi i a matou faʻamaumauga ma faʻasalalau AP-MS iʻuga mo Parkin43, masalo ona o le eseesega i le va o laina telefoni ma proteomics workflows.E fa'aopoopo i polotini e fa (ARDM1, HSPA8, PSMD14, ma le PSMC3) ua fa'ailoaina i auala e lua (Fig. 5c)43.Mo le faʻamaonia atili o taunuʻuga o le LC-MS / MS, PDPL togafitiga ma mulimuli ane Western blotting na faʻaaogaina e faʻatusatusa ai taunuʻuga o le HEK293T matua cell assay ma le N-terminal parkin line.O faʻamoemoega e leʻi iloa muamua CDK2, DUT, CTBP1, ma le PSMC4 na faʻataʻitaʻiina ma se faʻamaufaʻailoga iloa, DNAJB1 (Fig. 5d).
Volcano plot of parkin-interacting proteins in cell HEK293T with stably expressed miniSOG fused to the N- or C-terminus of parkin (n = 3 tutoatasi suʻesuʻega olaola).Sa fa'aogaina le su'ega-t-t-tailed Student i luga o fanua mauga mu.HEK293T na faʻaaogaina e fai ma pule le lelei. O polotini ua suia tele o lo'o fa'amamafaina i le mumu (p <0.05 ma le >2-fe'ese'esega o le malosi o le ion). O polotini ua suia tele o lo'o fa'amamafaina i le mumu (p <0.05 ma le >2-fe'ese'esega o le malosi o le ion). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). O polotini ua suia tele o lo'o fa'amamafaina i le mumu (p <0.05 ma le >2-fa'aiga le eseesega i le malosi o le ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). O polotini ua suia tele o lo'o fa'amamafaina i le mumu (p <0.05 ma le > 2-sa'iga eseesega i le malosi o le ionic).O palatini fa'atatau e taua mo HEK293T-miniSOG ae le taua mo HEK293T o lo'o fa'aalia i le lanu meamata.e Fa'atusa Venn o lo'o fa'aalia ai polotini felavasa'i i le va o le fa'aumu-N ma le fa'aumu-C.O pine N-terminal e mafai ona fa'agaoioia le paka ma maua ai ni polotini e iloagofie.c Venn ata o lo'o fa'aalia ai polotini fa'alava i le va o le PDPL ma le AP-MS.O lo'o lisiina tagata fa'aigoa ta'uta'ua, e aofia ai le 4 o le 18 o lo'o fa'apipi'i polotini ma le 11 o le 159 polotini ua fa'ailoa patino mai i le PDPL.d O sini sui na iloa e le LC-MS/MS na fa'amaonia e ala i Western blotting.e Ssu72 ma le SNW1 na fa'ailoaina o ni mea e le'i resitalaina paka.O nei FLAG-taged protein plasmids na faʻafeiloaʻi i HEK293T ma HEK293T-Parkin-miniSOG sosoo ai ma togafitiga CCCP i taimi eseese.O le faʻaleagaina na sili atu ona faʻaalia i le laina faʻaalia o Parkin.f I le faʻaaogaina o le inhibitor proteasome MG132, na faʻamaonia ai o le faʻaleagaina o le Ssu72 ma le SNW1 o loʻo faʻatautaia e le proteasome-ubiquitination.O nei fa'ata'ita'iga sa faia tuto'atasi pe a ma le fa'alua fa'atasi ma fa'ai'uga tutusa.O fa'amatalaga mata'utia o lo'o tu'uina atu i le tulaga o faila fa'amaumauga mata'utia.
Ae maise lava, o polotini ua faailoa mai e le PDPL e tatau ona aofia ai polotini e fusifusia paka ma a latou mea e fai.Ina ia iloa mea e le'i resitalaina paka paka, na matou filifilia ni polotini e fitu (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 ma SNW1) ma plasmids fa'aliliuina e fa'aalia ai nei kenera i HEK293T masani ma fa'aalia le miniSOG-Parkin's HEK293T togafitiga sosoo ai ma le CCCP.O le maualuga o le Ssu72 ma le SNW1 proteins na matua faʻaitiitia i le laina miniSOG-Parkin mautu (Fig. 5e).Togafitiga i le CCCP mo le 12 itula na i'u ai i le fa'aleagaina sili ona taua o mea uma e lua.Ina ia suʻesuʻeina pe o le faʻaleagaina o Ssu72 ma le SNW1 o loʻo faʻatonutonuina e le proteasome-ubiquitination, na faʻaopoopoina le inhibitor proteasome MG132 e faʻalavelave ai le gaioiga o le proteasome, ma o le mea moni na matou iloa ai o latou faʻaleagaina na faʻalavelaveina (Fig 5f).Na faʻamaonia faʻamoemoega faʻaopoopo e le o ni substrate e pei o Parkin fegalegaleai e faʻaaoga ai Western blotting (Faʻaopoopo Ata 10), lea na faʻaalia ai taunuuga faifaipea ma le LC-MS / MS.I le faaiuga, o le tuʻufaʻatasia o le galuega a le PDPL faʻatasi ai ma le faʻamaoniga o le transfection o le protein e mafai ai ona faʻamaonia le le resitalaina o le E3 ligase substrates.
Ua matou atia'e se fa'ailoga fa'ailoga masani e mafai ai ona e iloa i avanoa ma taimi e fegalegaleai ai POI.O le faʻavae e faʻavae i luga o le miniSOG photosensitizer protein, lea e naʻo le 12 kDa, e itiiti ifo i le afa o le tele o le APEX2 enzyme matua (27 kDa) ma le tasi vaetolu le tele o TurboID (35 kDa).Ole la'ititi la'ititi e tatau ona fa'alauteleina ai le tele o talosaga mo le su'esu'eina o feso'ota'iga polotini laiti.E mana'omia le su'esu'eina atili o mea fa'akomupiuta fa'aopoopo, pe fa'aigoaina fa'a-genes po'o molelaiti laiti, e fa'ateleina ai le fua tele o le okesene ta'ito'atasi ma fa'alautele ai le maaleale o lenei faiga.Mo le lomiga o loʻo iai nei o le miniSOG, e mafai ona ausia le maualuga maualuga o le faʻaogaina o le malamalama lanumoana e faʻagaoioia ai faʻailoga vavalalata.E le gata i lea, o le umi o le faʻaalia o le taimi na tuʻuina atu ai le tele o le "cloud" o le okesene singlet, e mafua ai le suiga o le tele o toega o le histidine, faʻateleina le laina faʻailoga, ma le mafai ona faʻaleleia lelei le PDPL spatial resolution.Sa matou fa'ata'ita'iina fo'i ni su'esu'ega fa'ama'i se fitu e fa'ateleina ai le fuafa'atatau o fa'ailo i tua ma su'esu'e le masini mole mole i tua atu o lenei faiga.Ole su'ega ole TOP-ABPP fa'atasi ai ma le su'esu'ega le fa'aituau na fa'amaonia ai na'o le histidines na tupu ai suiga ma e leai se microenvironment faifaipea na matauina mo le fa'ateleina o suiga ole histidine, se'i vagana ai le fa'aogaina o le histidines i totonu o le fa'amalo.
PDPL ua faʻaaogaina foʻi e faʻamaonia ai le puipuia o subcellular ma le proteome specificity ma le faʻapipiʻiina e sili atu ona faʻatusatusa i isi faʻailoga vavalalata ma metotia suʻesuʻe vailaʻau faʻapitoa.O faʻailoga vavalalata ua faʻaaogaina foi ma le manuia e faʻaalia ai luga, lysosomal, ma proteomes e fesoʻotaʻi faalilolilo46,47.Matou te talitonu o le PDPL o le a fetaui ma nei vaega laiti.E le gata i lea, na matou luitauina le PDPL e ala i le faailoaina o sini mo le fusifusia o le porotini cytosolic e sili atu le lavelave nai lo polotini fusifusia membrane ona o latou uiga malosi ma le auai i le tele o fegalegaleaiga faaletino.O le PDPL na faʻaaogaina i ni polotini se lua, o le transcriptional coactivator BRD4 ma le faʻamaʻi e fesoʻotaʻi ma ligase E3 Parkin.O nei polotini e lua na filifilia e le gata mo a latou galuega faʻale-aganuʻu, ae faʻapea foʻi mo lo latou aoga faʻapitoa ma togafitiga.Mo nei POI e lua, na iloa ai pa'aga ta'uta'ua fa'apea ma fa'amoemoe e le'i resitalaina.O le mea moni, o le SFPQ e fesoʻotaʻi ma le vavaeina o le vaega na faʻamaonia e le co-IP, lea e ono faʻaalia ai se masini fou e faʻatonutonu ai le BRD4 (short isoform) LLPS.I le taimi lava e tasi, matou te talitonu o le faʻamaoniaina o substrates Parkin o se faʻataʻitaʻiga lea e manaʻomia ai le faʻamaoniaina o mea faʻapipiʻi le tuusao.Na matou faʻailoaina ni mea e lua e leʻi faʻaalia ma faʻamaonia lo latou faʻaleagaina i luga o le auala ubiquitination-proteasome.Talu ai nei, o se taʻiala e faʻavae i luga o le masini na faʻavaeina e iloa ai mea e faʻaogaina ai le hydrolase e ala i le maileia i enzymes.E ui lava o se auala sili ona mamana, e le talafeagai mo le suʻesuʻeina o substrates o loʻo aʻafia i le faʻavaeina o lavelave tetele ma manaʻomia le faʻavaeina o fesoʻotaʻiga i le va o le enzyme ma le substrate.Matou te faʻamoemoe e mafai ona faʻalauteleina le PDPL e suʻesuʻe isi palatini faʻalavelave ma aiga enzyme, e pei o le deubiquitinase ma metalloprotease aiga.
O se ituaiga fou o le miniSOG, ua taʻua o le SOPP3, ua fausia ma faʻaleleia atili le gaosiga o le okesene.Na matou faʻatusatusaina le miniSOG ma le SOPP3 ma maua ai le faʻaleleia atili o le faʻailogaina, e ui lava o le faʻailoga-i-piʻo fua e tumau pea e le suia (Faʻaopoopo Ata 11).Na matou fa'apea o le fa'ata'ita'iina o le SOPP3 (fa'ata'ita'iga, e ala i le fa'atonuina o le evolusione) o le a ta'ita'iina atu ai i polotini photosensitizer e sili atu ona lelei e mana'omia ai le fa'apuupuu o le malamalama ma fa'ataga ai le fa'agaioiina o le telefoni feavea'i e pu'eina.Ae maise, o le lomiga o loʻo i ai nei o le PDPL e faʻatapulaʻa i le siʻosiʻomaga feaveaʻi ona e manaʻomia ai le malamalama lanumoana ma e le mafai ona ulu i totonu o le tino.O lenei vaega e taofia ai lona faʻaaogaina i suʻesuʻega faʻataʻitaʻiga manu.Ae ui i lea, o le tuufaatasiga o optogenetics ma le PDPL e mafai ona maua ai se avanoa mo suʻesuʻega manu, aemaise ile faiʻai.E le gata i lea, o isi mea fa'ainisinia infrared photosensitizers e aveesea foi lenei tapulaʻa.O lo'o fa'agasolo nei su'esu'ega i lea vaega.
Ole laina telefoni HEK293T na maua mai ile ATCC (CRL-3216).O le laina sela na suʻesuʻeina le leaga mo faʻamaʻi pipisi o le mycoplasma ma sa faʻatupuina ile DMEM (Thermo, #C11995500BT) faʻaopoopo i le 10% fetal bovine serum (FBS, Vistech, #SE100-B) ma le 1% penicillin/streptomycin (Hyclone, #SV30010).tupu i totonu.
3-Aminophenylene (faʻataʻitaʻiga 3) ma le (4-ethynylphenyl) metanamine (faʻataʻitaʻiga 4) na faʻatau mai Bidepharm.Propylamine (su'esu'e 2) na fa'atau mai Energy-chemicals.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (su'esu'e 1) na fa'apipi'iina e tusa ai ma metotia fa'asalalau.
O le Laulau Fa'aopoopo 1 o lo'o lisiina ai mea fa'apitoa na fa'aaogaina i lenei su'esu'ega.O le miniSOG ma KillerRed sequences na faʻapipiʻiina mai se plasmid meaalofa mai P. Zou (University Peking).O le mitochondrial matrix targeting sequence na maua mai i le 23 N-terminal amino acids o COX4 ma faʻapipiʻi i totonu o vete faʻaalia e faʻaaoga ai se faʻapotopotoga Gibson (Beyotime, #D7010S).Ina ia taulaʻi le membrane ma le nucleus o le endoplasmic reticulum, SEC61B DNA tagata (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) faʻateleina e le PCR mai le faletusi cDNA o sela HEK293T, ma le H2B DNA (foaʻiina e D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) ma cloned , e pei ona taʻua i luga.Se'i vagana ua fa'ailoa mai, o isi kenera polotini na fa'aaogaina mo le felauaiga ma le fausiaina o laina sela mautu na fa'ateleina le PCR mai le HEK293T cell cDNA library.G3S (GGGS) ma G4S (GGGGS) na faʻaaogaina e fai ma fesoʻotaʻiga i le va o le porotini maunu ma le miniSOG.O le V5 epitope tag (GKPIPNPLLGLDST) na faʻaopoopoina i nei faʻapipiʻiina.Mo faʻamatalaga i mamame ma faʻatūina se laina sela mautu, o le miniSOG fusion construct na faʻapipiʻiina i le pLX304 lentiviral vector.Mo faʻamatalaga faʻamaʻi, miniSOG na faʻapipiʻiina i totonu o le pET21a vector faʻaigoaina 6xHis i le C-terminus.
O sela HEK293T na totoina i le 2.0 x 105 sela i le vaieli i totonu o ipu e ono-vai ma faʻafeiloaʻi i le 24 itula mulimuli ane faʻatasi ai ma plasmids lentiviral recombinant (2.4 μg pLX304) ma plasmids afifiina viral (1.5 μg psPAX2 ma 1.2 μg pMD2.G0) faʻatasi ai ma le faʻaaogaina o Lipoyotime (LipoBeyotime). , #C0533), e tusa ma le 80% fusi.A mae'a le felauaiga i le po, ona suia lea o le alavai ma fa'a'a'a'a mo le isi 24 itula.O le aoina o le siama na faia ina ua maeʻa le 24, 48 ma le 72 itula.Aʻo leʻi oʻo i le faʻamaʻi pipisi o laina telefoni feaveaʻi, o le viral medium na faʻamaʻaina e ala i le 0.8 μm faamama (Merck, #millex-GP) ma polybrene (Solarbio, #H8761) na faʻaopoopoina i le faʻaogaina o le 8 μg / ml.A maeʻa le 24 itula, na faʻatagaina sela e toe faʻaleleia e ala i le suia o le ala.O sela na filifilia e faʻaaoga ai le 5 μg / ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) mo uluaʻi fuaitau e tolu e avea o se filifiliga faʻamalosi maualalo.Ona faʻaaogaina lea o le 20 μg / ml e avea o se faʻatonuga sili atu ona mamafa mo isi vaega e tolu.
Sa totoina sela i totonu o potu e 12-vaieli (Ibidi, #81201) i le mamafa e tusa ma le 20,000 sela i le vaieli.Ina ia faʻaleleia le pipii o sela HEK293T, faʻaopopo le 50 µg/ml fibronectin (Corning, #356008) faʻafefiloi i le phosphate buffered saline (PBS, Sangon, #B640435) ile 37°C.O potu na muai togafitia mo le 1 itula ona aveese lea i le PBS.A maeʻa le 24 itula, na fufuluina sela i le PBS, faʻapipiʻiina i le 1 mM suʻesuʻega 3 i le fou masima masima paleni a Hanks (HBSS, Gibco, #14025092) mo le 1 h i le 37 ° C, ona faʻapipiʻiina lea i se moli lanumoana (460 nm). ).) na faʻamalama mo le 10 min i le vevela o le potu.A maeʻa lena, na fufulu faalua i le PBS ma faʻapipiʻi i le 4% formaldehyde i le PBS (Sangon, #E672002) mo minute 15 i le vevela o le potu.O le tele o formaldehyde na aveese mai sela tumau e ala i le fufulu faatolu i le PBS.Ona fa'auluina lea o sela i le 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) i le PBS ma fufulu 3 taimi i le PBS.Ona aveese lea o le potu ma faʻaopopo i faʻataʻitaʻiga taʻitasi 25 µl o se paluga faʻafefiloi kiliki e iai le 50 μM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) ma le 0.5 mg / ml sodium ascorbate (Aladdin, nu. S105024) ma faʻafefe mo minute 30 i le vevela o le potu.Ina ua maeʻa se faʻalavelave faʻafuaseʻi, na fufuluina sela faʻaono i le PBS o loʻo i ai le 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) ona poloka lea i le 5% BSA (Abcone, #B24726) i le PBST mo le 30 minute i le vevela o le potu.
Mo colocalization immunostaining, sela sa incubated i antibodies muamua e tusa ai ma tulaga ua faailoa mai: isumu anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), lapiti anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), lapiti polyclonal anti-calnexin antibody (1:500, Abcam, #ab22595) poʻo lapiti anti-lamin A/C monoclonal antibody (1:500; CST, #2032) i le 4 °C i le po.Ina ua uma ona fufuluina 3 taimi i le PBST, sa incubated sela i antibodies lona lua: 'oti anti-lapiti Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) diluted 1:1000, 'oti anti-isu Alexa Fluor 594 (CST, #8889) diluted 1:1000.fa'aliga Fa'afefete ile vevela ole potu mo le 30 minute.Ona fufuluina lea o sela 3 taimi i le PBST ma faʻafefeteina ma le DAPI (Thermo, #D1306) i le PBS mo le 10 minute i le vevela o le potu.A maeʻa le 3 fufulu ma le PBS, na faʻamaufaʻailogaina sela i le 50% glycerol (Sangon, #A600232) i le PBS mo ata.Na maua ata o le Immunofluorescent i le fa'aaogaina o le ZEISS LSM 900 Airyscan2 confocal microscope ma le ZNE 3.5 software.
Mo le fa'ata'ita'iga fa'amalama o le okesene, na fufulu fa'alua sela i Hanks HEPES pa'u a'o le'i fa'aopoopoina le 100 nM Si-DMA ile Hanks HEPES pa'u (DOJINDO, #MT05).A maeʻa ona faʻaalia i le malamalama, na faʻapipiʻi sela i totonu o le CO2 incubator i le 37 ° C mo le 45 minute.Ona fufulu fa'alua lea o sela i le pa'u HEPES a Hanks ma fa'afete'ena'i ma le Hoechst i le pa'u HEPES a Hanks mo le 10 minute i le vevela o le potu ma va'aia i le fa'aogaina o le ZEISS LSM 900 confocal microscope., #M36008) i le HBSS paʻu e iai le calcium ma le magnesium.A maeʻa ona faʻaalia i le malamalama poʻo le doxorubicin (MCE, #HY-15142A), na faʻapipiʻiina sela i totonu o le CO2 incubator i le 37 ° C. mo 10 minute, fufulu faalua i le HBSS buffer, ma faʻapipiʻi ma Hoechst i le HBSS buffer i le vevela o le potu.minute.Doxorubicin na faʻaaogaina e avea o se suʻega suʻesuʻe lelei lea na togafitia ai sela i le 20 μM doxorubicin i le HBSS o loʻo i ai le 1% BSA mo le 30 min.O ata o le Immunofluorescent na maua mai ile fa'aogaina ole Zeiss LSM 900 confocal microscope.
O sela HEK293T o loʻo faʻaalia le mito-miniSOG na faʻapipiʻiina i le maualuga e tusa ma le 30% i ipu 15 cm.A maeʻa le 48 itula, ina ua oʻo i le 80% le faʻafeiloaʻiga, na fufuluina sela i le PBS, faʻapipiʻiina i le 1 mM Suʻesuʻe 3 i totonu o le HBSS fou mo le 1 itula i le 37 ° C ona faʻamalamalamaina lea i se moli lanumoana mo 10 minute i le potu. vevela..Mulimuli ane, na fufuluina faʻalua i le PBS, vaʻaia ma toe faʻafefe i totonu o le paʻu PBS malulu o loʻo i ai EDTA-free protease inhibitors (MCE, #HY-K0011).Sels sa lysed e ala i sonicating le pito mo le 1 minute (1 lona lua i luga ma le 1 lona lua i le 35% amplitude).O le faʻafefiloi na maua na faʻapipiʻiina i le 15,871 xg mo le 10 min i le 4 ° C e aveese ai otaota, ma o le maualuga o le supernatant na faʻafetaui i le 4 mg / mL e faʻaaoga ai le BCA protein assay kit (Beyotime, #P0009).Faʻatasi le 1 ml o le lysate i luga ma le 0.1 mM photodegradable biotin azide (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437), ma le 1 mM CuSO4 incubator. fesuia'i mo le 1 itula ile vevela ole potu.A mae'a se fa'alavelave fa'afuase'i, fa'aopoopo le fa'afefiloi i le vaifofo muamua fa'afefiloi (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) i totonu o se fagu tioata 10 ml.O faʻataʻitaʻiga na faʻafefiloi ma centrifuge i le 4500 g mo le 10 minute i le vevela o le potu.O vaifofo pito i lalo ma pito i luga na lafoai, o le faʻafefe na fufulu faalua i le 1 ml o le methanol ma faʻafefete i le 15871 × g mo le 5 min i le 4 ° C.Faʻaopoopo le 1 ml o le 8 M urea (Aladdin, nu. U111902) i le 25 mM ammonium bicarbonate (ABC, Aladdin, nu. A110539) e faʻamavae ai le pa.O faʻataʻitaʻiga na toe faʻaleleia i le 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 i le 25 mM ABC) mo minute 40 i le 55 ° C sosoo ai ma le faʻaopoopoga o le 15 mM fou iodoacetamide (Sangon, # A600539) i le vevela o le potu i le pogisa.Alkylation i totonu ole 30 minute..Ua faaopoopo le 5 mM dithiothreitol e taofi ai le gaioiga.Saunia pe a ma le 100 µl NeutrAvidin agarose lopa (Thermo, #29202) mo faʻataʻitaʻiga taʻitasi e ala ile fufuluina faʻatolu ile 1 ml PBS.O le vaifofo proteome o loʻo i luga na faʻafefeteina i le 5 ml PBS ma faʻapipiʻiina i le NeutrAvidin agarose lopa mo le 4 itula i le vevela o le potu.Ona fufuluina lea o pulu 3 taimi ma le 5 ml PBS o loʻo i ai le 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 taimi ma le 5 ml PBS o loʻo i ai le 1M urea, ma le 3 taimi ma le 5 ml ddH2O.Ona seleseleina lea o pulu i le centrifugation ma toe faʻamauina i le 200 μl o le 25 mM ABC o loʻo i ai le 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) ma le 20 ng / μl trypsin (Promega, #V5280).Trypsinize i le po i le 37°C ma le taamilosaga.Na taofia le tali e ala i le faaopoopoina o le formic acid (Thermo, # A117-50) seia oʻo i le pH 2-3.O loʻo fufuluina 3 taimi ma le 1 ml o le PBS o loʻo i ai le 0.2% SDS, 3 taimi ma le 1 ml o le PBS o loʻo i ai le 1 M urea, ona faʻatolu lea i le 1 ml o vai faʻafefe.O peptides faʻaleleia na faʻasaʻolotoina e le lysis malamalama (365 nm) mo le 90 min e faʻaaoga ai le 200 μl o le 70% MeOH.Ina ua uma le centrifugation, sa aoina le supernatant.Ona fufulu faatasi ai lea o lopa i le 100 μl o le 70% MeOH ma faʻapipiʻi supernatants.O faʻataʻitaʻiga sa faʻamago i totonu o le Speedvac vacuum concentrator ma teu i le -20 ° C seia oʻo i le auiliiliga.
Ina ia faʻailoa ma faʻatusatusa peptides faʻaleleia okesene, o faʻataʻitaʻiga na toe faʻamavaeina i le 0.1% formic acid ma le 1 μg o peptides na suʻesuʻeina e faʻaaoga ai le Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer faʻapipiʻiina ma le nano ESI puna mai Tune ma Xcalibur mai le polokalama faʻatau 4.3.O faʻataʻitaʻiga na vavae ese i luga o le 75 μm × 15 cm faʻapipiʻiina i totonu koluma capillary ma 3 μm C18 mea (ReproSil-pur, #r13.b9.) ma faʻafesoʻotaʻi i se EASY-nLC 1200 UHPLC system (Thermo).O peptides na vavaeeseina e le laina 95 minute gradient chromatography mai le 8% solvent B i le 50% solvent B (A = 0.1% formic acid i le vai, B = 0.1% formic acid i le 80% acetonitrile), ona fa'ateleina lea i le 98% B min. i le 6 min i le tafe o le 300 nl / min.Orbitrap Fusion Lumos e aoina faʻamatalaga i le va o le MS atoa ma le MS2 faʻatatau ile faʻamatalaga.O le voltage sputtering sa seti i le 2.1 kV ma le vevela o le capillary felauaiga ion sa 320 °C.MS spectra (350-2000 m/z) na aoina ma se iugafono o le 120,000, AGC 4 × 105, ma le maualuga o le taimi fa'aoga o le 150 ms.O le 10 sili ona masani fa'atele fa'amu'amea muamua i fa'ata'ita'iga atoa ta'itasi na vaevaeina i le fa'aogaina o le HCD fa'atasi ai ma le malosi fa'atosina masani o le 30%, o le fa'amalama fa'amavae fa'afa'afa o le 1.6 m/z, ma le fa'ai'uga o le 30,000.Se fa'amoemoega a le AGC mo fa'ata'ita'iga tele fa'atasi e fa'aaoga ai le 5x104 ma le maualuga o le taimi fa'aoga 150 ms.Ua seti le tuusaunoaga malosi i le 30 sekone. O ion e le'i tofiaina po'o i latou o lo'o i ai le moliaga o le 1+ ma le >7+ na te'ena mo MS/MS. O ion e le'i tofiaina po'o i latou o lo'o i ai le moliaga o le 1+ ma le >7+ na te'ena mo MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ ma >7+ были отклонены для МС/МС. O ion e le'i tu'uina atu po'o ion ma le tau o le 1+ ma le >7+ na te'ena mo MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于 MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于 MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ ma >7+ были отклонены для МС/МС. O ion e le'i fa'ailoaina po'o iona e iai moliaga o le 1+ ma le >7+ na te'ena mo MS/MS.
O faʻamatalaga mataʻutia o loʻo faʻaogaina e faʻaaoga ai le FragPipe computing platform e faʻavae ile MSFragger.O le fa'aituau fa'apitoa ma le amino acids tutusa na fa'atatau i le fa'aogaina o se su'esu'ega matala fa'atasi ai ma le fa'apalepale muamua o le -150 i le 500 Da.O peptides ua suia na faʻaalia i le faʻaaogaina o suiga o le histidine ma le tele o tupe maua o le +229.0964 ma le +247.1069 Da i le PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
O sela o loʻo faʻaalia le faʻaogaina o le miniSOG gene na faʻapipiʻiina i ipu 6 cm.I le oʻo atu i le ~ 80% faʻafeiloaʻiga, na fufuluina sela i le HBSS (Gibco, #14025092), ona faʻapipiʻiina lea i suʻega vailaʻau i le HBSS mo le 1 itula i le 37 ° C ma faʻamalamalamaina i le moli lanumoana.10W LED mo 20 minute ile vevela potu.Ina ia iloa po o le a le ituaiga o ituaiga o okesene faʻaalia o loʻo aʻafia i le PDPL, 0.5 mM vitamini C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 na faʻaopoopoina i sela e fai ma faʻaopoopoga.Ina ua uma le fufuluina ma le malulu PBS, na soloia sela, aoina i 1.5 ml centrifuge tubes, ma sonicated ma se pito mo 1 min i 200 μl o PBS ma 1x protease inhibitor e aunoa ma EDTA (1 s ma 1 s e aunoa ma, amplitude 35%).O le faʻafefiloi na maua na faʻapipiʻiina i le 15,871 × g mo le 10 min i le 4 ° C ma le faʻaogaina o le supernatant na faʻafetaui i le 1 mg / mL e faʻaaoga ai le BCA protein assay kit.E tusa ma le 50 µl o le lysate o loʻo i luga na faʻapipiʻiina i le 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, ma le 1 mM CuSO4 mo le 1 itula i le vevela o le potu ma le suiga mai lalo i luga.I le maeʻa ai o le kiliki, faʻapipiʻi le acetone e ala i le faʻaopoopoina o le 250 μl o le acetone muamua i faʻataʻitaʻiga, faʻapipiʻi i le -20 ° C mo le 20 min ma centrifuging i le 6010 × g mo le 10 min i le 4 ° C.Ao mai le pellet ma fa'avela ile 50 µl ole 1x Laemmli's buffer mo le 10 min ile 95 °C.Ona suʻesuʻeina lea o faʻataʻitaʻiga i luga o gels uumi SDS-PAGE ma vaʻaia i le faʻaogaina o le Bio-rad ChemiDoc MP Touch imaging system ma Image Lab Touch software.
Faʻaaliga ma faʻamamaina o le recombinant miniSOG-6xHis protein na faia e pei ona faʻamatalaina muamua.Faʻapuupuu, E. coli BL21 (DE3) sela (TransGen, # CD701-02) na liua ma pET21a-miniSOG-6xHis ma le faʻamatalaga o le protein na faʻaosoina i le 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).A maeʻa le lysis cell, na faʻamamāina polotini e faʻaaoga ai le Ni-NTA agarose beads (MCE, nu. 70666), faʻamama faʻasaga i le PBS, ma teuina i -80 ° C.
Mo se antibody-based in vitro label proximity assay, faʻafefiloi le 100 μM faʻamamaina miniSOG, 1 mM suʻesuʻega 3, ma le 1 μg anti-label mouse monoclonal antibody (TransGen, #HT501-01) i le PBS i le aofaʻi o tali o le 50 μl..O le faʻafefiloi o tali na faʻafefeina i le moli moli lanu moana mo le 0, 2, 5, 10, ma le 20 min i le vevela o le potu.O le faʻafefiloi na faʻapipiʻiina i le 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, ma le 1 mM CuSO4 mo le 1 h i le vevela o le potu i luga o se lulu agai i luga.A mae'a se tali vave, fa'aopoopo le 4x Laemmli's buffer sa'o ile paluga ma fa'apuna ile 95°C mo le 10 min.Sa suʻesuʻeina faʻataʻitaʻiga i luga ole SDS-PAGE gels ma suʻesuʻeina e ala ile paʻu i sisifo ma streptavidin-HRP (1: 1000, Solarbio, #SE068).
O le histidine-containing synthetic peptide ma le C-terminal amidation (LHDALDAK-CONH2) na faʻaaogaina e suʻesuʻe ai le peptide lata ane-faʻavae i le faʻailoga in vitro.I lenei suʻesuʻega, 100 μM faʻamamaina miniSOG, 10 mM suʻesuʻega 3 ma 2 μg / ml peptide synthetic na faʻafefiloi i le PBS i le aofaʻi o tali o le 50 μl.O le fa'afefiloiga tali sa fa'avelaina i le moli lanu moana LED mo le 1 itula ile vevela ole potu.E tasi le microliter o faʻataʻitaʻiga na suʻesuʻeina e faʻaaoga ai le LC-MS system (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight mass spectrometer ma MassLynx spectrum analysis software).
O sela HEK293T o loʻo faʻaalia ai le miniSOG fusion gene na faʻapipiʻiina i ipu 10 cm mo laina faʻatasi ai ma le eseese o le organelle localization (Mito, ER, Nucleus) ma ipu 15 cm mo laina Parkin-miniSOG ma BRD4-miniSOG.I le oʻo atu i le ~ 90% faʻafeiloaʻiga, na fufuluina sela i le HBSS, ona faʻapipiʻi lea i le suʻega 3 i le HBSS mo le 1 itula i le 37 ° C ma faʻamalamalamaina i le 10 W blue LED i le vevela o le potu.Mo le fa'ailogaina o Parkin e le fa'afeso'ota'i, 10 µM proton carbonyl cyanide carrier m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) fa'atasi ai ma su'esu'ega 3 i le HBSS na fa'aopoopoina mo le 1 itula ile 37°C.O le lysis cell, kiliki kemisi, faʻaitiitia ma le alkylation laasaga e tutusa lava e pei ona faʻamatalaina i luga, sei vagana ai le 2 mg o le lysate na faʻaopoopoina ma le biotin PEG3 azide na faʻaaogaina i le kiliki faʻaalia nai lo le photodegradable biotin azide.A maeʻa le faʻatamaoaigaina, na fufuluina lopa 3 taimi i le 5 ml o le PBS o loʻo i ai le 0.2% SDS, 3 taimi ma le 5 ml o le PBS o loʻo i ai le 1 M urea, ma le 3 taimi i le 5 ml o le PBS.Mulimuli ane, na faaopoopo le 2 μg trypsin i le 300 μl 25 mM ABC o loʻo i ai le 1 M urea e tipi ai le polotini i le po i le 37 ° C.Na taofia le tali e ala i le faaopoopoina o le formic acid seia oʻo i le pH o le 2-3.Ina ua uma le trypsinization i luga o pulu, o le vaifofo peptide sa desalted i le faaaogaina o le SOLAµ HRP koluma (Thermo, #60209-001) ma mago i se Speedvac vacuum concentrator.Peptides na toe faʻamuta i le 0.1% formic acid ma le 500 ng o peptides na suʻesuʻeina e faʻaaoga ai le Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer faʻapipiʻiina ma le nano-ESI puna o loʻo faʻamatalaina i luga.Peptides na vavaeeseina i luga o pisinisi RP-HPLC precolumns (75 μm x 2 cm) (Thermo, no. 164946) ma analytical RP-HPLC koluma (75 μm x 25 cm) (Thermo, no. 164941), faʻatumu uma i le 2 μm.gradient mai le 8% i le 35% ACN i le 60 minute, ona faʻateleina lea i le 98% B i le 6 minute i le tafe o le 300 Nl / min.MS spectra (350-1500 m/z) na aoina ma se iugafono o le 60,000, AGC 4 × 105, ma le maualuga o le taimi fa'aoga o le 50 ms.O ion filifilia na fa'asolosolo fa'asolosolo e le HCD i le 3 s cycles ma le malosi fa'atosina masani o le 30%, o se fa'amalama fa'a'ese'ese quadrupole o le 1.6 m/z, ma le fa'ai'uga o le 15000. A 5 × 104 tandem mass spectrometer AGC sini ma le maualuga taimi tui. o le 22 ms na faʻaaogaina.O le fa'ate'aina malosi ua fa'atulaga ile 45 sekone. O ion e le'i tofiaina po'o i latou o lo'o i ai le moliaga o le 1+ ma le >7+ na te'ena mo MS/MS. O ion e le'i tofiaina po'o i latou o lo'o i ai le moliaga o le 1+ ma le >7+ na te'ena mo MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ ma >7+ были отклонены для МС/МС. O ion e le'i tu'uina atu po'o ion ma le tau o le 1+ ma le >7+ na te'ena mo MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于 MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于 MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ ma >7+ были отклонены для МС/МС. O ion e le'i fa'ailoaina po'o iona e iai moliaga o le 1+ ma le >7+ na te'ena mo MS/MS.
O laʻasaga sauniuni faʻataʻitaʻiga e oʻo atu i le faʻatamaoaigaina o pulu NeutrAvidin e tutusa ma le LC-MS / MS auiliiliga o loʻo faʻamatalaina i luga.E tusa ma le 50 μg o le lysate na faʻaaogaina e fai ma faʻaoga mo le faʻatonuina o le utaina ma le 2 mg o le lysate na faʻaaogaina mo le kiliki.A maeʻa le faʻatamaoaigaina ma le fufuluina i le neutravidin, na faʻafefeteina polotini fusi e ala i le faʻaopopoina o le 50 μl o le paʻu a Laemmli i le agarose resin beads ma faʻafefe i le 95 ° C. mo le 5 minute.Pulea uta uta ma fa'atamaoaigaina fa'ata'ita'iga na su'esu'eina e le SDS-PAGE ma tu'u atu i le PVDF membranes (Millipore, #ISEQ00010) e ala i auala masani a Western blot.O paʻu na poloka i le 5% susu susu (Sangon, #A600669) i le TBS o loʻo i ai le 0.1% i le va o le 20 (TBST) ma faʻapipiʻi faʻasolosolo faʻatasi ma faʻamaʻi muamua ma lona lua.O fa'ama'i fa'amuamua na fa'afefeteina ile 1:1000 ile 5% susu susu ile TBST ma fa'asusu ile po ile 4°C.O faʻamaʻi faʻamalosi lona lua na faʻaaogaina i le fua faatatau o le 1: 5000 ma faʻapipiʻiina mo le 1 itula i le vevela o le potu.Na faʻaalia le paʻu e chemiluminescence e faʻaaoga ai le Chemidoc MP imaging system.O su'esu'ega uma e le'i tipiina o poloka ma gel i le ata o lo'o tu'uina atu o ni fa'amatalaga mata'utia.
O faʻamaʻi muamua na faʻaaogaina i lenei suʻesuʻega e aofia ai le lapiti anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, no. 71992), lapiti anti-FUS monoclonal antibody (CST, no. 67840), lapiti anti-NSUN2 polyclonal antibody (Proteintech, no. 20854-1- AP), lapiti anti-mSin3A polyclonal antibody (Abcam, #ab3479), isumu anti-tag monoclonal antibody (TransGen, #HT201-02), isumu anti-β-actin monoclonal antibody (TransGen, #HC201-01), lapiti anti -CDK2 monoclonal antibody (ABclonal, #A0094), lapiti monoclonal antibody i le CTBP1 (ABclonal, #A11600), lapiti polyclonal antibody i DUT (ABclonal, #A2901), lapiti polyclonal antibody i PSMC4 (ABclonal, #A2505), lapiti antibody DNAJB1 polyclonal antibody (ABclonal, # A5504).O nei antibodies sa fa'aogaina ile 1:1000 fa'afefiloi ile 5% susu susu ile TBST.O antibodies lona lua na faʻaaogaina i lenei suʻesuʻega e aofia ai le anti-rabbit IgG (TransGen, #HS101-01), anti-mouse IgG (TransGen, #HS201-01) i le 1: 5000 dilution.
Ina ia suʻesuʻe atili pe fegalegaleai le BRD4 ma le SFPQ, o sela HEK293T ma BRD4-miniSOG faʻamauina o loʻo faʻaalia HEK293T na faʻapipiʻiina i ipu 10 cm.Na fufulu sela i le PBS malulu ma faʻamama i le 1 ml Pierce IP lysis buffer (Thermo Fisher, #87787) faʻatasi ma le EDTA-free protease inhibitor mo 30 minute i le 4 ° C.Ina ua uma lena, sa aoina lysates i 1.5 ml centrifuge tubes ma centrifuged i 15,871 xg mo 10 min i 4 ° C.O le supernatant sa seleseleina ma fa'a'a'ofu i le 5 µg o le anti-V5 fa'ailoga monoclonal antibody (CST, #80076) i le po i le 4°C.Fufulu pe tusa ma le 50 µl o polotini A/G maneta lopa (MCE, #HY-K0202) fa'alua ile PBS e iai le 0.5% Tween-20.Ona faʻapipiʻiina lea o lysates cell i pulu mageta mo le 4 itula i le 4 ° C ma le taamilosaga mai lalo i luga.Ona fufulu fa'afa lea o pulu i le 1 ml o le PBST buffer ma kuka i le 95 ° C mo le 5 min.Sa suʻesuʻeina faʻataʻitaʻiga i luga ole SDS-PAGE gels ma tuʻuina atu ile PVDF membranes e faʻaaoga ai auala masani a Western blot.Na poloka le pa'u ile 5% susu susu ile TBST ma fa'asusu fa'asolosolo fa'atasi ma fa'ama'i fa'ama'i muamua ma lona lua.Primary Antibody Rabbit anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, #71992) sa fa'aogaina i le fua faatatau o le 1:1000 i le 5% susu susu i le TBST ma fa'asusu i le po i le 4°C.Anti-rabbit IgG sa fa'aogaina i le fua faatatau o le 1:5000 ma fa'asusu mo le 1 itula i le vevela o le potu.Na faʻaalia le paʻu e chemiluminescence e faʻaaoga ai le Chemidoc MP imaging system.
O fausaga uma na faʻaaogaina mo le Solvent Accessible Surface Area (SASA) suʻesuʻega na maua mai le Protein Data Bank (PDB)52 poʻo le AlphaFold Protein Structure Database53.Sa fuafuaina le SASA atoatoa mo toega ta'itasi e fa'aaoga ai le polokalame FreeSASA.Na'o fa'amaumauga SASA atoatoa ma le manino mo histidine fa'ailoga ma ona tuaoi na fa'aogaina e maua ai le uiga SASA mo fausaga ta'itasi.Ole feso'ota'iga ole solvent accessibility (RSA) mo histidine ta'itasi sa fuafuaina e ala ile vaevaeina o le tau SASA atoatoa e ala ile fa'aogaina ole maualuga ole vaega o lo'o avanoa ile solvent.Ona fa'avasegaina uma lea o histidines e natia pe afai o le fua faatatau RSA e i lalo ifo o le 20%, a leai e fa'aalia56.
O faila mataʻutia na maua i le DDA mode na suʻesuʻeina e faʻaaoga ai le Proteome Discoverer (v2.5) poʻo le MSfragger (Fragpipe v15.0) i totonu ole SwissProt faʻamaonia faʻamaumauga porotini faʻamaonia o loʻo i ai mea faʻaleagaina masani.O peptides e manaʻomia le trypsin atoa ma ni nofoaga e lua o loʻo misi, o le carbamoyl methylation e avea o se suiga tumau ma le faʻamaʻiina o le methionine o se suiga malosi.O le fa'apalepale o le mamafa ma le vaevaega na fa'atulaga i le 10 ppm ma le 0.02 Da (MS2 Orbitrap), i le faasologa. Na aveese mea faʻaleagaina, ma faʻamama polotini ina ia maua ai se fua faatatau o le mauaina sese o le <1%. Na aveese mea faʻaleagaina, ma faʻamama polotini ina ia maua ai se fua faatatau o le mauaina sese o le <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, a белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного 1%. Na aveese mea fa'aleaga ma fa'amama polotini ina ia maua ai se fua faatatau sese o le <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, a белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаруже%. Na aveese mea fa'aleagaina ma fa'amama polotini ina ia maua ai se fua faatatau lelei sese o le <1%.Mo su'esu'ega fa'afuainumera e aunoa ma le fa'aogaina o fa'ailoga, sa fa'aogaina ai mea fa'apolotini masani mai fa'asologa fa'aola e tolu.O le suʻesuʻeina o le localization o le protein subcellular na faia i le faʻaaogaina o Gene Ontology (GO) suʻesuʻega mai le DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 ma faʻamaumauga tuʻufaʻatasia ma faʻasalalau e le Alice Ting group.O le faafanua o le mauga mu na maua mai ia Perseus (v1.6.15.0). O suiga o le gaugau tele o polotini na tofotofoina mo le taua o fuainumera e faaaoga ai se su'ega t-itu-lua, ma na maua ai le polotini i le tele o suiga>2 (sei vagana ua ta'ua) ma le p tau <0.05. O suiga o le gaugau tele o polotini na tofotofoina mo le taua o fuainumera e faaaoga ai se su'ega t-itu-lua, ma na maua ai le polotini i le tele o suiga>2 (sei vagana ua ta'ua) ma le p tau <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Na fa'ata'ita'iina suiga ole gaugau i totonu ole polotini mo le taua fa'afuainumera e fa'aaoga ai le t-su'ega lua-si'u, ma fa'afetauiga porotini na fa'ailoa ile suiga ole anotusi>2 (sei vagana ua fa'ailoaina) ma le tau aoga <0.05.使用 双边 检验 检验 检验 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 统计 显着性 显着性 显着性 显着性 蛋白质 蛋白质 中 中 的 变化 变化 变化 (除非 另 和 和 和 和 值) 和 <0.05.使用 双边 检验 检验 检验 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 的 变化 变化 变化> 变化 (另 和) 和 <0.05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. O le taua o fuainumera o suiga gauga i totonu o le porotini na faʻataʻitaʻiina i le faʻaogaina o le t-suʻega lua, ma faʻatusatusaga porotini na fuafuaina mo suiga o mea> 2 (sei vagana ua faʻaalia) ma p-values <0.05.Sa faia le suʻesuʻega o fesoʻotaʻiga protein i le faʻaogaina o le GO suʻesuʻega faʻatasi ai ma le faʻamaumauga o String.
E tolu fa'ata'ita'iga fa'aola na fa'ataunu'uina fa'atasi ai ma taunu'uga tutusa.Sa faia su'esu'ega fa'amaumauina i le GraphPad Prism (GraphPad software) ma fa'ata'ita'iga o mauga mu na fausia ma Perseus (v1.6.15.0).Ina ia faʻatusatusa vaega e lua, na faʻamoemoeina p-values i le faʻaaogaina o le t-suʻega lua-tailed Student's t-test.Na'o proteins singleton na iloa e le itiiti ifo i le faalua i le vaega faʻataʻitaʻi na aofia i totonu o fanua mauga mu, ma o mea taua o loʻo misi i le vaega faʻatonutonu na suia i Perseus mai se tufatufa masani ina ia mafai ai ona fuafua le tau-p.Fa'amau fa'aletonu o lo'o fa'atusalia ai le uiga ± fa'asologa masani.I su'esu'ega fa'akomepiuta mo su'esu'ega fa'afuainumera, o le tele o polotini na aliali mai i le le itiiti ifo ma le lua fa'asologa o mea ola na taofia.E le'i fa'aogaina metotia fa'afuainumera e fa'amautu ai le tele o fa'ata'ita'iga.O fa'ata'ita'iga e le fa'afuase'i.E leʻi tauaso le au suʻesuʻe i galuega i le taimi o suʻega ma iloiloga o taunuʻuga.
Mo nisi faʻamatalaga e uiga i suʻesuʻega suʻesuʻega, vaʻai i le Nature Research Report faʻamatalaga e fesoʻotaʻi ma lenei tusiga.
O faʻamaumauga o spectrometry tele na maua i lenei suʻesuʻega na tuʻuina atu i le ProteomeXchange Consortium e ala i le faleoloa paaga iProX57 i lalo ole ID ID PXD034811 (PDPL-MS dataset).O fa'amatalaga mata'utia o lo'o tu'uina atu i le tulaga o faila fa'amaumauga mata'utia.O lenei tusiga o loʻo tuʻuina atu ai faʻamatalaga muamua.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Malamalama i le pitonu'u: fa'aogaina le biotinylation e fa'alagolago i le vavalalata e fa'ailoa ai mea lavelave porotini ma fa'afanua okeni. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Malamalama i le pitonu'u: fa'aogaina le biotinylation e fa'alagolago i le vavalalata e fa'ailoa ai mea lavelave porotini ma fa'afanua okeni.Gingras, AS, Abe, KT ma Raut, B. Fa'amasani ma si'osi'omaga: fa'aogaina le biotinylation fa'alagolago-fa'alatalata e fa'ailoa ai fa'apolotini lavelave ma fa'afanua okeni. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Malamalama i le pitonu'u: fa'aoga le fa'alagolago o le pitonu'u i le ola olaola.Gingras, AS, Abe, KT ma Raut, B. Malamalama i le vavalalata: faʻataʻitaʻiga o faʻalavelave palatini ma faʻafanua o okeni e faʻaaoga ai le biotinylation faʻalagolago.I le taimi nei.O lo'u manatu.Kemisi.biology 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Fa'afanua le si'osi'omaga laiti e ala i le fa'aliliuina atu o le malosi o Dexter i sela fa'asao.Saienisi 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.O feso'ota'iga fua e lua-proteome e iloa ai le toe fa'afouga fa'apitoa ole sela ole feso'ota'iga a tagata.Selula 184, 3022–3040.e3028 (2021).
Taimi meli: Sep-15-2022
